There is currently no text in this page. You can search for this page title in other pages, search the related logs, or edit this page.
Stage:139
From Master 2 Recherche Biosciences Végétales
Laboratoire d'accueil : LIPM
Equipe d'accueil : Transcriptome et gènes régulateurs symbiotiques chez Medicago truncatula
Encadrant(e)(s) : Andreas Niebel tel: 0561285327, mel: andreas.niebel@toulouse.inra.fr
Par une approche transcriptomique nous avons isolé le facteur de transcription (TF) NF-YA1 spécifiquement exprimé au cours de l’interaction symbiotique, entre les bactéries fixatrices d’azote communément appelées Rhizobia et la légumineuse modèle Medicago truncatula ,et dont il contrôle plusieurs étapes clés. NF-YA1 appartient à la famille des CCAAT box Binding Factor, connus pour agir au sein de complexes avec d’autres FT ou des modificateurs de chromatine. Nous cherchons donc à identifier les interacteurs de NF-YA1 afin de mieux comprendre son fonctionnement et sa régulation. Ce projet de M2 se divise en deux grandes parties. 1) la caractérisation de deux régulateurs transcriptionnels de la famille des JAZ, identifiés par criblage double hybride.2) l’identification de nouveaux interacteurs du complexe NF-Y symbiotique par la technique du TAP (Tandem Affinity Purification), menée en collaboration avec des spécialistes belges de la technique.
Afin d’identifier des protéines interagissant avec NF-YA1 nous poursuivons deux stratégies majeures dans lesquelles ce sujet de thèse s’intègre.
1) Le criblage de banques double hybride dans la levure
Par cette approche nous avons, en plus des sous unités NF-YC2 et NF-YB16 identifié deux gènes homologues codants pour des interacteurs du complexe NF-YA1. Ces genes codent pour des facteurs de transcription de la famille des JAZ (JASMONATE ZIM-domain) appartenant à la grande famille des proteines TIFY (Vanholme 2007). Nous les avons donc respectivement appelés TIN1 et TIN2 pour (TIFY-protein Involved in Nodulation). Les protéines TIFY ont la capacité de s’associer avec des facteurs de transcription et de moduler leur activité transcriptionelle (Vanholme et al., 2007).
Dans cette partie de la thèse nous prévoyons de :
i) Confirmer et approfondir l’interaction entre le complexe NF-Y et les protéines TIN dans la levure et « in planta » par la technique de BiFC (Bimolecular Fluorescent Complementation) et CoiP (co-immunoprecipitation).
ii) Caractériser finement l’expression de TIN1 et TIN2 par suivi d’une construction rapportrice promoteur-GUS.
iii) Caractériser la fonction de TIN1 et TIN2 à l’aide de mutants d’insertion (déjà identifiés) de constructions RNAi ainsi que de surexpresseurs (En cours)
iv) Une grande partie des protéines TIFY fonctionnent comme des represseurs transcriptionnels. En collaboration avec des spécialistes des protéines JAZ (Alain GOOSSENS, VIB, Belgium) qui ont mis au point un test d’activation dans des protoplastes de tabac nous testerons si les protéines TIFY fonctionnent elles aussi comme des répresseurs in planta.
2) L’identification de complexes protéiques in planta via l’approche TAP-TAG.
L’approche de purification par affinité en tandem (TAP) est l’une des méthodes de purification de protéines par affinité les plus puissantes pour l’identification de complexes et réseaux protéiques (Braun, 2013). Des racines transgéniques exprimant une fusion entre NF-YA1 et une étiquette de poly-affinité ont été envoyées aux spécialistes européens de cette technique chez Arabidopsis thaliana et Medicago truncatula (Geert de Jaeger, Sofie Goormachtig,VIB, Gent, Belgique.
L’immunopurification ainsi que l’identification des protéines associées dans le même complexe par MS/MS sont en cours au VIB (Gent) et une liste d’interacteurs candidats devrait donc être disponible en Octobre 2014.
Un ou deux candidats prometteurs sera alors choisi(s) et étudiés plus avant selon le schéma suivant :
i) Caractérisation fine de l’expression par q-RTPCR et par suivi d’une construction rapportrice promoteur-GUS.
ii) Confirmation de l’interaction entre le complexe NF-Y et les protéines TIN « in planta » par la technique de BiFC (Bimolecular Fluorescent Complementation) et CoiP (co-immunoprecipitation).
iii) Caractérisation de la fonction à l’aide de constructions RNAi ainsi que de surexpresseurs.