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Stage:140
From Master 2 Recherche Biosciences Végétales
Laboratoire d'accueil : Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes UMR CNRS-INRA 2594/441, BP52627, 31326 Castanet-Tolosan
Equipe d'accueil : Signaux symbiotiques et leur perception/transduction (Clare Gough/Julie Cullimore)
Encadrant(e)(s) : Christine Hervé christine.herve@toulouse.inra.fr tél:05 61 28 53 22
De nombreuses plantes terrestres pour assurer leur croissance vivent en symbiose avec des champignons et plus rarement avec des bactéries. Les légumineuses s’associent à la fois avec des bactéries du sol du type Rhizobium qui fixent l’azote atmosphérique au sein d’organes spécifiques qui se forment sur les racines, les nodules et des champignons endomycorhiziens à arbuscules (AM) qui facilitent assimilation du phosphate par la plante. L’établissement de ces symbioses nécessite un véritable dialogue moléculaire entre les partenaires et bien que les processus symbiotiques soient favorables aux deux organismes, des mécanismes de retro contrôle fins sont nécessaires pour maintenir des conditions développementales favorables aux deux organismes partenaires (Oldroyd, 2013). Par des approches génétiques, des gènes de légumineuses impliqués dans la perception et la transduction des signaux émis par les microrganismes partenaires ont été identifiés (Oldroyd and Downie, 2008). Plusieurs d’entre eux codent des protéines transmembranaires ayant une structure similaire à un récepteur (DMI2, LYK3, NFP). Des criblages double-hybride chez la levure ont permis d’isoler un partenaire des récepteurs DMI2 et LYK3, une E3 ubiquitine ligase appelée MtPUB1 (Medicago truncatula Plant U-box protein). MtPUB1, est induit précocement au cours de la nodulation et de la mycorrhization et en réponse aux facteurs LCOs produits par deux partenaires symbiotiques de M. truncatula, Sinorhizobium meliloti et Rhizophagus irregularis. MtPUB1 joue un rôle négatif dans la mise en place de la nodulation et de la mycorhization. Il est trans-phosphorylé par les domaines kinase de DMI2 et LYK3 et présente une activité d’auto-ubiquitination in vitro et in planta. Il a été montré que dans une lignée mutante ayant perdue l’activité ubiquitine ligase de MtPUB1, la régulation réalisée par celui-ci n’est plus effective. L’ensemble de ces données sont publiés par Mbengue et al., 2010 et en cours de publication par Vernié et al., soumis. Des données récentes obtenues par spectrométrie de masse (MS) ont permis d’identifier plusieurs sites de phosphorylation sur MtPUB1 après phosphorylation in vitro par le domaine kinase de LYK3. L’introduction de mutations mimant une phosphorylation des résidus sérine et thréonine identifiés phosphorylés par MS dans la région essentielle de MtPUB1 à l’interaction avec les domaines kinase des récepteurs DMI2 et LYK3, montre un impact négatif de ces phosphorylations sur l’interaction avec DMI2 et LYK3.
L’objectif de ce stage sera de comprendre le rôle de la modification des capacités d’interactions de MtPUB1, dans les voies de transduction symbiotiques.
1-Validité in planta
Une première étape consistera en la validation des résultats obtenus chez la levure in planta. Des expériences de co-expression suivie de co-immunopurification (CoIP) de DMI2, LYK3 et MtPUB1 seront réalisées chez N. benthamiana.
2- Etude de la localisation sub-cellulaire de MtPUB1 sauvage ou muté
Des expériences utilisant des constructions fluorescentes de MtPUB1 sauvage ou muté permettront de définir le(s) compartiment(s) sub-cellulaire(s) où se trouvent ces protéines. Une approche par fractionnement cellulaire sera menée en parallèle.
3- Tests de complémentation
Afin d’évaluer l’importance fonctionnelle de ces mutations de MtPUB1 dans les processus symbiotiques, des tests de complémentations d’une lignée mutante pub1-1 seront réalisées avec la forme sauvage ou mutée de la protéine.
L’ensemble des résultats obtenus permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels MtPUB1 régule des processus symbiotiques.
Techniques utilisées
Clonage, mutagénèse, Western blot, immunoprécipitation, fractionnement cellulaire, agroinfiltration de N. benthamiana, transformation de M. truncatula par A. rhizogenes
Références bibliographiques
Oldroyd G. (2013). Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants. Nat Rev Microbiol.;11: 252-63.
Mbengue M., Camut S., de Carvalho-Niebel F, Deslandes L., Froidure S., Klaus D., Moreau S., Rivas S., Hervé C., Cullimore J., and Lefebvre B. (2010). The Medicago truncatula E3 ubiquitin ligase, MtPUB1, interacts with the LYK3 symbiotic receptor and negatively regulates nodulation. The Plant Cell, 22: 1-16.