Stage:146

From Master 2 Recherche Biosciences Végétales

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Etude de l’impact de RRS1-R, une protéine de résistance aux phytopathogènes, sur la transcription des gènes de la plante en réponse à un facteur d’avirulence de Ralstonia solanacearum.

Laboratoire d'accueil : LIPM, Laboratoire des Interactions Plantes Microorganismes
Equipe d'accueil : Résistance, sensibilité et mort cellulaire chez Arabidopsis thaliana en réponse à des bactéries pathogènes (Y. Marco et D. Roby)
Encadrant(e)(s) : Dominique Trémousaygue, dominique.tremousaygue@toulouse.inra.fr, 05-61-28-53-21

Thématique :
Les végétaux sont sans cesse confrontés aux attaques de nombreux organismes phytopathogènes qui dans certains cas entrainent un affaiblissement ou la mort de la plante.
La plupart des plantes sont capables de se protéger naturellement par la mise en place de systèmes de défense qui permettent de limiter ou stopper le développement d’un pathogène. Les études réalisées dans ce champ d’investigation ont pu mettre en évidence deux types de défenses chez les végétaux supérieurs suivant la nature de l’attaque subie, la résistance basale ou PTI (PAMP Triggered Immunity), et la résistance spécifique ou ETI (Effector Triggered Immunity).
Des approches moléculaires et génétiques, réalisées sur l’organisme modèle Arabidopsis thaliana (A.thaliana), ont permis d’identifier des gènes importants pour l’issue de l’interaction (résistance ou sensibilité), entre la plante et une bactérie du sol qui cause d'importants dégâts sur de nombreuses espèces végétales d'intérêt agronomique, Ralstonia Solanacearum. Les résultats mettent en lumière des mécanismes complexes résultant d’un dialogue moléculaire entre les deux partenaires, bactérie et végétal.
Dans ce contexte une protéine de résistance, RRS1-R a été identifiée (Deslandes, 1998, 2002, 2003). RRS1-R permet la reconnaissance d’un effecteur de R. solanacearum, Pop P2 et entraine la résistance spécifique de la plante. D’autres études ont montré par la suite que RRS1-R contrôle des processus majeurs pour la mise en place de la résistance, conservés vis-à-vis de plusieurs pathogènes et dans différentes espèces végétales (Narusaka et al, 2009). Cette protéine de résistance possède une structure modulaire associant les domaines typiques de nombreuses protéines de résistance TIR-NBS-LRR et un domaine signature de facteurs de transcription WRKY. RRS1-R remplit ainsi potentiellement, suite à la perception de l’effecteur dans la cellule végétale, une fonction de régulateur transcriptionnel . De fait, une importante reprogrammation de l’expression des gènes de la plante a été mise en évidence dans diverses analyses transcriptomiques en réponse à la bactérie R.solanacearum ou en réponse à l’expression, dans la plante, de l’effecteur Pop P2 (Hu et al, 2008, Feng et al, 2012, données non publiées). En utilisant une approche DamID (German et Gaudin, 2011), qui permet l’identification de cibles directes d’un facteur de transcription, nous avons récemment identifié des régions d’ADN reconnues in vivo par RRS1-R, dans deux conditions expérimentales, en absence de l’effecteur bactérien ou suite à l’induction de son expression dans les plantes. Parmi les régions identifiés, quelques loci, qui correspondent à des gènes codant des éléments connus de la réponse des plantes aux pathogènes, ont été choisis pour déchiffrer plus précisément le mode d’action de RRS1-R. Le stage aura trois objectifs, présentés ci-dessous. Les approches expérimentales qui seront utilisées sont précisées en suivant:
1-Valider la fixation de RRS1-R sur ses cibles par ImmunoPrécipitation de Chromatine (ChIP).
2-Etablir une corrélation entre la présence de RRS1 sur l’ADN et le niveau d’expression des gènes avoisinants mesuré par QRT PCR.
3-Evaluer la structure de la chromatine dans les régions ou RRS1-R est localisée. En effet la convergence de plusieurs approches suggère aujourd’hui l’importance de modifications de la structure de l’ADN dans la mise en place des réponses des plantes à R.solanacearum : la technique de DNase1-PCR sera mise en oeuvre à cette fin.
Notre objectif, à plus long terme, sera de comprendre le rôle des gènes cibles dans le processus de réponse des plantes aux bactéries et de modéliser les processus moléculaires contrôlés par RRS1-R qui sous tendent la réponse des plantes à R.solanacearum. Ces travaux s’inscrivent dans la recherche de moyens de lutte contre le flétrissement bactérien, moyens aujourd’hui très limités voire inexistants.
Méthodologies utilisées :
Chip : Cross link des complexes ADN –proteins, extraction de la chromatine et sonication, immunoprécipitation des complexes RRS1-R/ADN, quantification par PCR avec des amorces spécifiques des cibles choisies selon le protocole décrit par Roccaro and Somssich (Methods in Molecular Biology (2011).Vol 712, pp 45-58)
qRT PCR : Extraction des ARNs, transcription reverse des cDNA et PCR en temps réel (Lighcycler Roche) avec des amorces spécifiques.
Test d’accessibilité de la chromatine: Préparation de chromatine, digestion à la Dnase1 et PCR sur les cibles sélectionnées selon le protocole décrit par Shu et collaborateurs ( Plant physiol, (2013). vol 162, pp.1794-1801)

References:
Deslandes, L., Pileur, F., Liaubet, L., Camut, S., Can, C., Williams, K., Holub, E., Beynon, J., Arlat, M., and Marco, Y. (1998). Mol Plant Microbe Interact 11, 659-667
Deslandes, L., Olivier, J., Theulieres, F., Hirsch, J., Feng, D.X., Bittner-Eddy, P., Beynon, J., and Marco, Y. (2002). Proc Natl Acad Sci U S A 99, 2404-2409.
Deslandes, L., Olivier, J., Peeters, N., Feng, D.X., Khounlotham, M., Boucher, C., Somssich, I., Genin, S., and Marco, Y. (2003). Proc Natl Acad Sci U S A 100, 8024-8029
Feng, D.X., Tasset, C., Hanemian, M., Barlet, X., Hu, J., Trémousaygue, D., Deslandes, L., and Marco, Y. (2012). New Phytol 194, 1035-1045.
Germann, S., and Gaudin, V. (2011). Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 754.
Hu, J., Barlet, X., Deslandes, L., Hirsch, J., Feng, D.X., Somssich, I., and Marco, Y. (2008). Plos One 3
Narusaka, M., Shirasu, K., Noutoshi, Y., Kubo, Y., Shiraishi, T., Iwabuchi, M., and Narusaka, Y. (2009). RRS1 and RPS4 provide a dual Resistance-gene system against fungal and bacterial pathogens. Plant Journal 60.