There is currently no text in this page. You can search for this page title in other pages, search the related logs, or edit this page.
Stage:147
From Master 2 Recherche Biosciences Végétales
Laboratoire d'accueil : "Génomique et Biotechnologie des Fruits" (GBF) et Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes (LIPM)
Equipe d'accueil : Dominique Roby / Yves Marco
Encadrant(e)(s) : Corinne Audran (05 34 32 38 66 / corinne.audran@ensat.fr) et Susana Rivas (05 61 28 53 26/ susana.rivas@toulouse.inra.fr).
Vers le transfert des connaissances des plantes modèles aux espèces cultivées: étude du rôle de MYB30 dans les réactions de défense chez la tomate
1. RESUME DU SUJET
Les plantes ont développé des mécanismes de signalisation et de défense complexes afin de se protéger contre les agents pathogènes potentiels. L’une des manifestations la plus rapide et la plus efficace de la mise en place de cette résistance est la réponse hypersensible (HR), caractérisée par une mort rapide et localisée au site d’inoculation. La HR permet le confinement de l’agent pathogène, empêchant ainsi sa dissémination au delà du site d’infection.
La reprogrammation transcriptionelle de la cellule végétale est une étape clé qui implique des changements majeurs de l’expression de gènes conduisant à l’établissement de la réponse de défense de la plante face à l’attaque des agents pathogènes. Chez Arabidopsis thaliana, le facteur de transcription (FT) de type MYB MYB30 est un régulateur positif des voies de transduction contrôlant la mise en place de la défense végétale et de la HR, à travers l’activation d’une voie de synthèse de lipides conduisant à la production d’acides gras à très longue chaine (VLCFA)1,2. De plus, l’effecteur bactérien XopD est capable de cibler MYB30, ce qui conduit à une suppression des réponses de défense, soulignant ainsi l’importance du rôle joué par MYB30 en tant que régulateur de la résistance chez Arabidopsis3.
L’activation des mécanismes de défense végétale est un processus énergétiquement coûteux pour la plante qui se doit d’être finement régulé. Dans ce contexte, nous avons a mis en évidence une régulation très fine de l’activité de MYB30 qui s’effectue à travers son interaction avec des protéines activatrices ou inhibitrices, ou par la mise en place de modifications post-traductionnelles. En particulier, MYB96, un FT phylogénétiquement proche de MYB30, coopère avec lui dans l’activation transcriptionnelle de la voie VLCFA et dans la régulation de la défense et de la HR de la plante. De plus, différents partenaires protéiques de MYB30, dont la phospholipase secrétée AtsPLA2-? (spécifiquement relocalisée vers le noyau en présence de MYB30)4, la protéine de type RING E3 ubiquitine ligase MIEL1 (capable d’ubiquitiner MYB30 et conduire à sa dégradation)5 et une protéase de la famille de subtilases (capable de dégrader MYB30), régulent négativement l’activité de MYB30 et, par conséquent, la résistance chez Arabidopsis.
La compréhension des mécanismes moléculaires contrôlant la résistance des plantes représente aujourd’hui un intérêt majeur dans la protection des cultures. Dans ce contexte, le transfert de connaissances acquises chez les plantes modèles vers des espèces d’intérêt agronomique nécessite des études en amont. De façon intéressante, nous avons montré que MYB30 est aussi capable de réguler positivement les réponses de défense chez N. tabacum et N. benthamiana, ce qui suggère que ce rôle de MYB30, ainsi que les éléments de signalisation nécessaires à la réaction de défense, seraient conservés chez les Solanacées6.
Dans ce projet, nous nous proposons donc d’évaluer le rôle de MYB30 dans les réactions de défense chez la tomate, l’espèce modèle chez les Solanacées. La réalisation de ce projet sera possible grâce aux données de séquençage du génome de la tomate obtenues récemment7. Chez Arabidopsis, MYB30 appartient au sous-groupe phylogénétique S1 avec 5 membres et défini par la présence des motifs C-terminaux YASSxxNI et SL[F/I]EKWLF[D/E]8. Une étape préliminaire à ce travail a consisté à déterminer si ce sous-groupe phylogénétique est aussi présent chez la tomate en recensant l’ensemble des gènes potentiellement orthologues à MYB30. Par recherche in silico dans la base de données SGN (http://www.sgn.cornell.edu), nous avons montré l’existence de 5 protéines putatives de tomate présentant les motifs YASSxxNI et SL[F/I]EKWLF[D/E] caractéristiques du sous-groupe MYB S1. Une analyse plus poussée des séquences de ces 5 protéines nous a permis d’identifier un gène candidat qui serait l’orthologue de MYB30 chez la tomate. Nous avons également identifié des protéines de tomate présentant de très fortes homologies de séquences avec les protéines MIEL, avec AtsPLA2-? et avec la subtilase (54-84% d’identité selon les candidats). Ces résultats préliminaires indiquent que MYB30, le sous-groupe phylogénétique S1 et les protéines régulatrices de MYB30 sont conservées chez la tomate. Suite à ces analyses phylogénétiques, l’objectif de ce projet est d’entreprendre une analyse fonctionnelle de ces différents candidats afin d’initier l’étude de leur rôle potentiel dans les réactions de défense et de la HR chez la tomate.
2. APPROCHES ENVISAGEES
Dans le but de confirmer le gène candidat identifié comme l’orthologue de MYB30 chez la tomate, les approches suivantes sont envisagées:
- Au sein du sous-groupe MYB S1 d’Arabidopsis, seulement l’expression de MYB30 et MYB96 est rapidement induite après inoculation avec la bactérie phytopathogène Xanthomonas campestris. Une analyse spatio-temporelle de l’expression des 5 gènes de tomate après inoculation avec Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) sera réalisée par qRT-PCR.
- La localisation subcellulaire de protéines potentiellement partenaires de MYB30 identifiées chez la tomate fusionnées à de protéines fluorescentes sera analysée par microscopie confocale chez N. benthamiana. De plus, l’interaction protéique entre les 5 protéines MYB candidates et les protéines homologues à MIEL, à AtsPLA2-? et à la subtilase, ainsi que avec l’effecteur de Xanthomonas XopD, sera analysée par la technique de FRET-FLIM, en collaboration avec Alain Jauneau et Cécile Pouzet (Plateforme Imagerie FR3450).
- Nos connaissances sur la spécificité d’interaction entre MYB30 et ses protéines partenaires chez Arabidopsis, ainsi que sur les profils d’expression de gènes MYB après inoculation, nous permettront de confirmer l’identité de l’orthologue de MYB30 afin de mener une étude fonctionnelle, à la fois: (i) par génétique inverse (génération de plantes transgéniques sous-exprimant le gène candidat par RNAi chez la tomate), et (ii) par la recherche de mutants «TILLING» disponibles à l’INRA de Bordeaux (https://www.bordeaux.inra.fr/umr619/tilling.htm). Le phénotypage des lignées de tomate obtenues après inoculation avec Xcv sera basé sur l’analyse (i) des réactions de défense (mesure de la croissance bactérienne in planta), (ii) des réponses de mort cellulaire associées (tests visuels et de quantification du développement de la HR)) et (iii) sur l’activation transcriptionnelle des gènes cibles de MYB30 de type VLCFA.
3. ENCADRANTS
Ce projet sera co-encadré par Corinne Audran (corinne.audran@ensat.fr; GBF) et par Susana Rivas (susana.rivas@toulouse.inra.fr; LIPM)
4. REFERENCES
1 Raffaele S., Vailleau F., Leger A., Joubes J., Miersch O., Huard C., Blee E., Mongrand S., Domergue F., Roby D. A MYB transcription factor regulates Very-Long-Chain Fatty Acid biosynthesis for activation of the hypersensitive cell death response in Arabidopsis. Plant Cell 20, 752-767 (2008).
2 Raffaele, S. & Rivas, S. Regulate and be regulated: integration of defense and other signals by the AtMYB30 transcription factor. Front Plant Sci 4, 98 (2013).
3 Canonne J, Marino D, Jauneau A, Pouzet C, Brière C, Roby D and Rivas S. The Xanthomonas type III effector XopD targets the Arabidopsis transcription factor AtMYB30 to suppress plant defence. Plant Cell 23, 3498-3511 (2011).
4 Froidure S, Canonne J, Daniel X, Jauneau A, Brières C, Roby D and Rivas S. AtsPLA2-alpha nuclear relocalization by the Arabidopsis transcription factor AtMYB30 leads to repression of the plant defense response. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 15281-15286 (2010).
5 Marino D, Froidure S, Canonne J, Ben Khaled S, Khafif M, Jauneau A, Pouzet C, Roby D and Rivas S. Arabidopsis ubiquitin ligase MIEL1 mediates degradation of the transcription factor MYB30 weakening plant defence. Nat Commun 4, 1476 (2013).
6 Vailleau, F. et al. A R2R3-MYB gene, AtMYB30, acts as a positive regulator of the hypersensitive cell death program in plants in response to pathogen attack. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 10179-10184 (2002).
7 The Tomato Genome Consortium. The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution. Nature 485, 635-641, doi:10.1038/nature11119 (2012).
8 Daniel, X., Lacomme, C., Morel, J.-B. & Roby, D. A novel myb oncogene homolog in Arabidopsis thaliana related to the hypersensitive cell death. Plant J. 20, 57-66 (1999).