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Stage:154
From Master 2 Recherche Biosciences Végétales
Laboratoire d'accueil : Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes (LIPM)
Equipe d'accueil : Dominque Roby/Yves Marco
Encadrant(e)(s) : Laurent Deslandes - Laurent.Deslandes@toulouse.inra.fr - 0561285509
Résumé du sujet
La bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum, l’agent du flétrissement bactérien, est une des phytobactérioses les plus dévastatrices à l’échelle planétaire puisqu’elle affecte plus de 200 espèces végétales dont certaines d’intérêt agronomique. Chez Arabidopsis thaliana, le couple de protéines de résistance RPS4 et RRS1-R est impliqué dans la reconnaissance de l’effecteur PopP2 de Ralstonia (Deslandes et al., 2003; Deslandes et al., 2002). RPS4 et RRS1-R possèdent des domaines TIR-NBS-LRR qui sont présents chez de nombreuses protéines de résistance. RRS1-R se distingue de RPS4 de par la présence d’un domaine WRKY de liaison à l’ADN, caractéristique d’une famille de facteurs de transcription végétaux. De récents travaux publiés dans la prestigieuse revue « Science » font état d’une interaction physique entre ces deux protéines qui s’associent sous la forme d’un hétérodimère capable de percevoir la présence de certains effecteurs et notamment celle de PopP2 (Williams et al., 2014). Toutefois, les mécanismes moléculaires permettant au complexe RPS4/RRS1-R de percevoir PopP2 et d’activer les réponses de défense restaient mal connus.
L’activité acétyltransférase a pu être démontrée (Tasset et al., 2010). Nous avons récemment identifié le domaine WRKY de RRS1-R comme étant un substrat de PopP2. L’acétylation de RRS1-R est directement impliquée dans l’activation de la réponse immunitaire puisqu’elle empêche RRS1-R de réguler négativement l’expression de gènes de défense. Nos résultats indiquent que le récepteur RRS1-R se comporte comme un « senseur » capable de percevoir directement l’activité enzymatique de PopP2 dont la fonction ancestrale de virulence consiste à acétyler des facteurs de transcription WRKY en vue d’affecter leurs activités transcriptionnelles. Ces travaux ont donc permis d’élucider le lien qui existe entre les fonctions de virulence de PopP2 et son activité élicitrice de l’immunité (article en cours de rédaction).
Le stage proposé à pour objectif de progresser dans la compréhension des bases moléculaires qui sont impliquées dans la manipulation des protéines WRKY par PopP2. Nos données indiquent que, hormis la triade catalytique de PopP2 qui est nécessaire à l’activité acétyltransférase (moitié C-terminale), la partie N-terminale de cet effecteur semble également avoir un rôle dans la manipulation de l’activité transcriptionnelle des protéines WRKY.
Au cours de son stage, l’étudiant(e) sélectionné(e) s’intéressera donc à différentes questions :
- la fonction de virulence de PopP2 nécessite-t-elle la participation concomitante de l’extrémité N-terminale et de la triade catalytique ? Pour répondre à cette question, la réponse phénotypique de plantes d’Arabidopsis inoculées par des souches de Ralstonia produisant différents variants de PopP2 (effecteur muté dans sa partie N-terminale et/ou C-terminale) sera étudiée.
- l’extrémité N-terminale de PopP2 influence-t-elle la capacité de PopP2 à acétyler les protéines WRKY ? Pour ce faire, des expériences de co-expression de protéines WRKY en présence des différents variants de PopP2 cités précédemment seront réalisées chez N. benthamiana. Les protéines extraites seront soumises à des expériences d’immunoprécipitations de protéines acétylées en vue de détecter/quantifier le niveau d’acétylation des protéines WRKY.
- les protéines WRKY sont elles également ciblées par PopP1, un effecteur de Ralstonia qui appartient à la même famille que PopP2 (la famille YopJ) ? A ce jour, les cibles de PopP1 ne sont pas connues. Les facteurs WRKYs constituent donc des cibles potentielles de PopP1. Pour tester cette hypothèse, des tests d’acétylation réalisées in planta ou in vitro (production de protéines recombinantes chez E. coli) seront réalisés.
- l’importance fonctionnelle de certains facteurs WRKY qui sont pressentis comme ayant un rôle important dans la réponse à Ralstonia (impliqués soit dans le développement de la sensibilité, soit dans celui de la résistance) sera entreprise par le biais de la technologie CRISPR-Cas9 (Hsu et al., 2014) permettant de générer des mutations ciblées dans un génome d’intérêt (ici Arabidopsis). En effet, pour certains gènes WRKY, nous ne disposons pas des mutants nuls correspondants. Au cours du stage, l’obtention de mutants wrky par « Genome editing » sera donc entreprise (transformation de plantes via Agrobacterium, sélection de plantes transgéniques, génotypages par PCR...). Les mutants wrky ainsi générés seront par la suite inoculés avec une souche de Ralstonia produisant PopP2 afin de voir si leurs réponses phénotypiques diffèrent de celle d’un génotype sauvage (accélération ou ralentissement dans la cinétique d’apparition des symptômes de flétrissement).
L’élucidation des mécanismes de virulence des agents pathogènes bactériens revêt un intérêt tout particulier d’un point de vue fondamental. A terme, ces recherches ont pour ambition de développer de nouveaux mécanismes de résistance permettant de lutter efficacement contre des agents pathogènes particulièrement dévastateurs.
Encadrant de stage
Dr Laurent Deslandes (Laurent.Deslandes@toulouse.inra.fr)
Références bibliographiques :
Deslandes, L., Olivier, J., Peeters, N., Feng, D.X., Khounlotham, M., Boucher, C., Somssich, I., Genin, S., and Marco, Y. (2003). Physical interaction between RRS1-R, a protein conferring resistance to bacterial wilt, and PopP2, a type III effector targeted to the plant nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 8024-8029.
Deslandes, L., Olivier, J., Theulieres, F., Hirsch, J., Feng, D.X., Bittner-Eddy, P., Beynon, J., and Marco, Y. (2002). Resistance to Ralstonia solanacearum in Arabidopsis thaliana is conferred by the recessive RRS1-R gene, a member of a novel family of resistance genes. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 2404-2409.
Hsu, P.D., Lander, E.S., and Zhang, F. (2014). Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell 157, 1262-1278.
Tasset, C., Bernoux, M., Jauneau, A., Pouzet, C., Brière, C., Kieffer-Jacquinod, S., Rivas, S., Marco, Y., and Deslandes, L. (2010). Autoacetylation of the Ralstonia solanacearum effector PopP2 targets a lysine residue essential for RRS1-R-mediated immunity in Arabidopsis. PLoS Pathog 6, e1001202.
Williams, S.J., Sohn, K.H., Wan, L., Bernoux, M., Sarris, P.F., Segonzac, C., Ve, T., Ma, Y., Saucet, S.B., Ericsson, D.J., et al. (2014). Structural basis for assembly and function of a heterodimeric plant immune receptor. Science 344, 299-303.