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Stage:167
From Master 2 Recherche Biosciences Végétales
Laboratoire d'accueil : Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes
Equipe d'accueil : Dominique Roby/Susana Rivas
Encadrant(e)(s) : Irene Serrano (imserranoval@toulouse.inra.fr) et Susana Rivas (susana.rivas@toulouse.inra.fr)
1.RESUME DU SUJET
Les plantes ont développé des mécanismes de signalisation et de défense complexes afin de se protéger contre les agents pathogènes potentiels. La mise en place des réactions de défense est un processus énergétiquement très coûteux pour la plante. Dans ce contexte, un contrôle précis de ce processus se révèle donc être essentiel lors de l’attaque par un agent pathogène. La protéine de type RING E3 ligase MIEL1 a été identifiée dans notre équipe comme un régulateur négative des réponses de défense chez la plante modèle Arabidopsis thaliana (Marino et al., 2013). En effet, MIEL1 est capable d’interagir avec MYB30, un facteur de transcription (FT) MYB d’Arabidopsis qui régule de façon positive des voies de transduction contrôlant la mise en place de la défense de la plante à travers l’activation transcriptionnelle de la synthèse de lipides conduisant à la production d’acides gras à très longue chaine (VLCFA) (Vailleau et al., 2002; Raffaele et al., 2008; Raffaele and Rivas 2013). L’interaction de MIEL1 avec MYB30 permet l’ubiquitination du FT et conduit à sa dégradation par le protéasome et, par conséquent, à une régulation négative de l’activation transcriptionnelle des gènes VLCFA et de la résistance de la plante (Marino et al., 2013). D’autres données montrent que l’expression de MIEL1 est réprimée après inoculation suggérant donc que cette E3 ligase serait impliquée dans la répression de la voie VLCFA à travers la dégradation de MYB30 en absence de la bactérie afin de prévenir une accumulation superflue du FT, ce qui serait inutilement coûteux pour la plante.
De façon intéressante, l’analyse de l’expression de MIEL1 au cours du développement a identifié le grain de pollen comme le tissue où MIEL1 est exprimé de façon plus importante (Borges et al., 2008). De plus, l’expression de MIEL1 est réprimée au cours de la germination du tube pollinique, suggérant ainsi un rôle régulateur pour MIEL1 dans ce processus (Borges et al., 2008). Il est aussi important de rappeler ici que de molécules dérivées des VLCFAs sont des composés majeurs de la couche externe du pollen et que celle-ci joue un rôle crucial dans la protection du gamétophyte male, dans la germination du pollen à la surface de le stigmate et dans la croissance du tube pollinique à travers le tissue du style afin d’attendre l’ovule (Elleman et al., 1992; Preuss et al., 1993 ; Quilichini et al., 2015; Haslam et al., 2015). En accord avec la forte expression de MIEL1 dans le pollen et avec son rôle régulateur de la synthèse des VLCFA, nous avons montré récemment qu’après germination, les tubes polliniques du mutant d’Arabidopsis miel1 sont significativement plus courts que ceux de la lignée sauvage dans les mêmes conditions, ce qui semble confirmer notre hypothèse que MIEL1 pourrait contrôler un processus développemental au niveau du pollen. De plus, la modification de la composition ou du recyclage de la couche externe du pollen pourrait faciliter l’accessibilité du pollen à divers agents pathogènes. Nos observations sont particulièrement intéressantes à la lumière du nombre grandissant de données indiquant que certains régulateurs des réponses de défense seraient également impliqués dans le contrôle de divers processus développementaux chez les plantes (Shi et al., 2012 ; Yang et al., 2012 ; Lozano-Duran and Zipfel 2015).
Dans le but de mieux comprendre comment MIEL1 peut réguler la germination du tube pollinique et les réactions de défense, dans ce projet nous nous proposons d’identifier et d’initier la caractérisation fonctionnelle de protéines partenaires de MIEL1 au niveau du pollen. Les candidats potentiels isolés seront comparés à ceux identifiés comme interagissant avec MIEL1 chez de plantes adultes d’Arabidopsis après inoculation bactérienne. L’analyse fonctionnelle des candidats identifiés dans les deux conditions nous permettra d’aborder la question du rôle de MIEL1 situé à l’interface de la défense et le développement de la plante.
2.APPROCHES ENVISAGEES
Dans le but d’identifier et de caractériser de protéines partenaires (cibles) de MIEL1, une approche multidisciplinaire est envisagée comprenant une grande diversité de techniques de laboratoire:
- Un crible double hybride chez la levure sera réalisé avec une banque d’ADNc de pollen obtenue à travers une collaboration avec le laboratoire du Dr. David Hoyns (Institute of Experimental Biology, République Tchèque) afin d’identifier de partenaires protéiques (cibles) de MIEL1. Etant donnée l’activité d’E3 ligase de MIEL1, la réalisation du crible avec la version sauvage de la protéine pourrait conduire à la dégradation des protéines cibles ce qui empêcherait leur identification lors du crible double hybride. Afin de maximiser nos chances d’identifier de protéines candidates, le crible double hybride sera réalisé en utilisant comme appât une de MIEL1 mutée au niveau de son domaine catalytique.
- Les candidats potentiels identifiés seront comparés à ceux identifiés lors d’un autre crible double hybride réalisé dans notre équipe en utilisant MIEL1 comme appât et avec une banque d’ADNc générée à partir de plantes d’Arabidopsis après inoculation bactérienne. La priorité de l’analyse fonctionnelle de candidats sera portée sur les candidats communs identifiés lors des deux cribles.
- Le profile d’expression des candidats potentiels identifiés sera étudié au cours du développement chez Arabidopsis afin de vérifier leur co-expression avec MIEL1.
- La localisation subcellulaire de protéines potentiellement partenaires de MIEL1 identifiées fusionnées à de protéines fluorescentes sera analysée par microscopie confocale chez N. benthamiana.
- De plus, l’interaction protéique entre les protéines candidates et MIEL1 sera confirmée in planta par la technique de FRET-FLIM, en collaboration avec Alain Jauneau et Cécile Pouzet (Plateforme Imagerie FR3450) ainsi que par co-immunoprecipitation.
- Afin d’initier l’analyse de la fonction des candidats sélectionnés, des lignées d’insertion ADN-T d’Arabidopsis seront obtenues à partir des collections de mutants (NASC). La présence de l’ADN-T à l’état homozygote sera vérifiée para PCR à partir d’ADN génomique et l’effet de l’insertion sur le niveau de transcrit des gènes candidats évalué par q-RT-PCR. Le phénotypage de ces lignées sera initié sur la base de l’analyse (i) de la formation du pollen; (ii) la germination du tube pollinique, et (iii) le niveau de résistance (mesure de la croissance bactérienne in planta). En fin, le niveau d’activation transcriptionnelle des gènes de la voie VLCFA sera également analysé à la fois dans le pollen et dans les plantes adultes avant et après inoculation bactérienne.
3. ENCADRANTS
Ce projet sera réalisé au Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes (LIPM) et co-encadré par Irene Serrano (imserranoval@toulouse.inra.fr) et par Susana Rivas (susana.rivas@toulouse.inra.fr).
4. REFERENCES
-Borges F., Gomes G., Gardner R., Moreno N., McCormick S., Feijo J.A. and Becker J.D. (2008) Comparative transcriptomics of Arabidopsis sperm cell. Plant Physiology, 148: 1168-1181.
-Elleman C.J., Franklin-Tong V. and Dickinson H.G. (1992). Pollination in species with dry stigmas: The nature of the early stigmatic response and the pathway taken by pollen tubes. New Phytologist, 121: 413-424.
-Haslam T., Haslam R.P., Thoraval D., Pascal S., Delude C., Domergue F., Mañas-Fernandez A., Beaudoin F., Napier A., Kunst L. and Joubès J. (2015) CER2-LIKE proteins have unique biochemical and physiological functions in very-long-chain fatty acid elongation. Plant Physiology, 167: 682-692.
-Lozano-Duran R. and Zipfel C. 2015. Trade-off between growth and immunity: role of brassinosteroids. Trends in Plant Science, 20: 12–19
-Marino D., Froidure S., Canonne J., Ben Khaled S., Khafif M., Pouzet C., Jauneau A., Roby D. and Rivas S. (2013). Arabidopsis ubiquitin ligase MIEL1 mediates degradation of the transcription factor MYB30 weakening plant defence. Nature Communications, 4: 1476.
-Preuss D., Lemieux B., Yen G. and Davis RW (1993) A conditional sterile mutation eliminates surface components from Arabidopsis pollen and disrupts cell signaling during fertilization.Genes and Development, 7: 974-985.
-Quilichini, T.D., Grienenberger, E. and Douglas, C.J. (2015) The biosynthesis, composition and assembly of the outer pollen wall: A tough case to crack. Phytochemistry, 113: 170-182.
-Raffaele S. and Rivas S. (2013). Regulate and be regulated: integration of defense and other signals by the AtMYB30 transcription factor. Frontiers in Plant Sciencie, 4: 98.
-Raffaele S., Vailleau F., Lèger A., Joubès J., Miersch O., Huard C., Blée E., Mongrand S., Domergue F. and Roby D. (2008) A MYB transcription factor regulates very-long-chain fatty acid biosynthesis for activation of thehypersensitive cell death response in Arabidopsis. Plant Cell, 20: 752–767
-Shi Z., Maximova S., Liu Y., Verica J. and Guiltinan M.J. (2012). The salicylic acid receptor NPR3 is a negative regulator of the transcriptional defense response during early flower development in Arabidopsis. Molecular Plant, 6 :802-816. .
-Yang D.L., Yao J., Mei C.S., Tong X.H., Zeng L.J., Li Q., Xiao L.T., Sun T.P. Li J., Deng X.D. Lee C.M., Thomashow M.F., Yang Y., He Z. and Shen Y.H. (2012) Plant hormone jasmonate prioritizes defense over growth by interfering with gibberellin signaling cascade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 109: E1192-200.
-Vailleau F., Daniel X., Tronchet M., Montillet J.L., Trianta-phylides C. and Roby D. (2002) A R2R3-MYB gene, AtMYB30, acts as a positive regulator of the hypersensitive cell death program in plants in response to pathogen attack. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 99: 10179-10184.