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Stage:176
From Master 2 Recherche Biosciences Végétales
Laboratoire d'accueil : LIPM, Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes UMR CNRS-INRA 2594/441,
Equipe d'accueil : Signaux symbiotiques et leur perception/transduction (Clare Gough/Julie Cullimore)
Encadrant(e)(s) : Christine Hervé (Christine.Herve@toulouse.inra.fr)
Les endosymbioses confèrent aux plantes des capacités d’assimilation particulières mais aussi une plus grande résistance à un certain nombre de stress abiotiques et biotiques. Ainsi, les associations symbiotiques entre les champignons endomycorhiziens (AM) ou plus spécifiquement entre les légumineuses et rhizobia sont d’importances capitales pour le développement des plantes et favorisent une agriculture plus respectueuse de l’environnement en limitant la quantité d’intrants. Des équipes Toulousaines ont identifié que les facteurs Nod (NFs), des lipochitooligosaccharides (LCOs) produits par les rhizobia sont des molécules indispensables à la nodulation des plantes agronomiquement intéressantes et que les AM produisent des molécules signales structurellement très proches appelés Myc-LCOs (Maillet et al., 2011) ainsi que des oligomères courts de chitine impliqués dans les réponses symbiotiques de la plante aux AM (Genre et al., 2013). Dans la plante modèle Medicago truncatula, trois récepteur-like kinases (RLKs) (NFP, LYK3 et DMI2) situés sur la membrane plasmique jouent des rôles majeurs dans la signalisation des NFs et Myc-LCOs. Ces récepteurs contrôlent étroitement les processus d’infection et d’organogénèse du nodule et DMI2 joue également un rôle majeur dans la mycorhization. Actuellement il n’est pas clair comment les différents facteurs sont perçus et l’information transmise par les récepteurs symbiotiques pour activer les réponses symbiotiques, ni comment ces signaux, structurellement proches conduisent à des réponses spécifiques (Gough et Cullimore, 2011). La protéine MtPUB1 est un élément précoce de la voie de transduction de ces deux endosymbioses et interagit avec les domaines cytoplasmiques des récepteurs DMI2 et LYK3. MtPUB1 possède une activité E3 ubiquitine ligase caractérisée in vitro nécessaire à la régulation négative des deux endosymbioses (Vernié et al., résultats non publiés) et est phosphorylée in vitro par les protéines kinase DMI2 et LYK3. La compréhension de l’intégration et de la transduction des signaux symbiotiques est essentielle pour permettre de nouvelles avancées dans l’utilisation agronomique de ces symbioses. Déterminer comment MtPUB1 agit sur le contrôle de l’infection via les récepteurs symbiotiques constitue donc un enjeu d’importance majeur.
Des données récentes obtenues par spectrométrie de masse (MS) ont permis d’identifier plusieurs sites de phosphorylation sur MtPUB1 après phosphorylation in vitro par le domaine kinase de LYK3. L’introduction de mutations mimant une phosphorylation des résidus sérine et thréonine identifiés phosphorylés par MS dans la région essentielle de MtPUB1 à l’interaction avec les domaines kinase des récepteurs DMI2 et LYK3, montre un impact négatif de ces phosphorylations sur l’interaction avec DMI2 et LYK3 chez la levure et in planta.
L’objectif de ce stage sera de démontrer l’importance des phosphorylations de MtPUB1 pour son fonctionnement moléculaire lors de la signalisation symbiotique (nodulation et mycorhization) et de déterminer l’impact des nouveaux acteurs interagissant avec MtPUB1.
1-Une recherche détaillée des bases moléculaires de l’interaction entre MtPUB1 et les récepteurs symbiotiques DMI2 et LYK3.
i)- Analyse de l’impact de la phosphorylation sur les capacités d’interaction de MtPUB1 avec les récepteurs symbiotiques.
Les données préliminaires obtenues chez la levure et in planta suggèrent fortement qu’une forme de MtPUB1 mimant une phosphorylation totale de son domaine ARM, domaine essentiel à l’interaction avec les récepteurs DMI2 et LYK3 conduit à une dissociation de MtPUB1. Des expériences complémentaires sont encore nécessaires avant une conclusion définitive.
ii)- Analyse de l’impact de la phosphorylation sur l’activité ubiquitine ligase de MtPUB1.
Les données préliminaires obtenues dans l’équipe en utilisant des formes mimant une phosphorylation ou une non phosphorylation de deux résidus identifés phosphorylés par MS dans le domaine U-box de MtPUB1 suggèrent que la sérine 354 pourrait être une cible importante pour réguler l’activité ubiquitine ligase de MtPUB1. L’ubiquitination des protéines MtPUB1 modifiées et sauvage sera comparée par western blot.
iii)- Rôle fonctionnel
Afin d’évaluer l’importance fonctionnelle de la phosphorylation de MtPUB1 dans les processus symbiotiques (nodulation et mycorhization), des expériences de sur expression seront réalisées chez Medicago truncatula avec la forme sauvage ou les formes mimant la phosphorylation ou la non phosphorylation. Le phénotype symbiotique des plantes transformées sera analysé.
2- Une analyse des nouveaux interacteurs de MtPUB1
Lors d’un criblage double hybride dans la levure avec la protéine MtPUB1, deux protéines codant respectivement une UDP-glucuronique acide décarboxylase et un RLK de type « cystéine-rich » ont été identifiés comme interacteur. Les candidats seront analysés pour :
i)- Déterminer leur rôle symbiotique
Des lignées Tnt1 chez M. truncatula ont été identifiées pour les deux candidats. Des lignées homozygotes ont été sélectionnées et seront analysées pour leur aptitude à la nodulation et à la mycorhization.
ii)- Valider leur interaction avec PUB1 in planta
Cette confirmation d’interaction entre MtPUB1 et les candidats sera effectuée par co-immunopurification (Co-IP) chez N. benthamiana après clonage des gènes candidats dans des vecteurs d’expression de plantes.
ii)- Tester leur ubiquitination par MtPUB1
Afin de déterminer si les protéines interagissant avec MtPUB1 sont des substrats de son activité ubiquitine ligase, des tests d’ubiquitination seront réalisés in vitro et également in planta par co-expression des protéines à tester chez N. benthamiana et l’ajout une forme étiquetée d’ubiquitine. Il peut s’avérer que les candidats sélectionnés ne soient pas des substrats pour l’activité ubiquitine ligase de MtPUB1, ils n’en demeurent pas moins des nouveaux acteurs potentiels de la signalisation symbiotique.
L’ensemble des résultats obtenus permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels MtPUB1 régule des processus symbiotiques.
Techniques utilisées
Clonage, Western blot, immunopurification, agroinfiltration de N. benthamiana, transformation de M. truncatula par A. rhizogenes, analyse de la nodulation et de la mycorhization
Références bibliographiques
Oldroyd G. (2013) Nat Rev Microbiol.;11: 252-63.
Gough C, Cullimore J (2011) Mol Plant Microbe Interact. 24: 867-78 ;
Maillet F et al.,(2011) Nature 469: 58-63 ; Mbengue M et al., 2010. Plant Cell. 10: 3474-88.
Mbengue M et al.,(2010) The Plant Cell, 22: 1-16.