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Stage:49

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Etude des mécanismes de la translocation cytoplasme-noyau de la GAPDH lors de mise en place de la mort cellulaire induite par les sphingolipides chez les végétaux


Laboratoire d'accueil : UMR CNRS-UPS 5546, Surfaces Cellulaires et Signalisation chez les Végétaux
Equipe d'accueil : Signalisation calcique cytosolique et nucléaire chez les végétaux. (Responsable : Christian Mazars). .
Encadrant(e)(s) : Patrice Thuleau (05 34 32 38 06; thuleau@scsv.ups-tlse.fr)

Chez les plantes, il est aujourd’hui établi que la mort cellulaire programmée (PCD) intervient aussi bien dans les processus de développement et de différenciation que dans les réactions de défense contre des agents pathogènes. Néanmoins, contrairement à ce qui est connu chez les animaux, les mécanismes de mort cellulaire chez les plantes sont encore mal élucidés. Au laboratoire, nous avons récemment montré que certains sphingolipides provoquent une PCD de cellules de tabac BY-2 et induisent, au préalable, des variations calciques à la fois dans le cytosol et dans le noyau de ces cellules. De manière intéressante, si les variations de calcium nucléaire sont spécifiquement inhibées, la PCD induite pas les sphingolipides est bloquée (Lachaud et al. 2010). A cette première série de données, qui suggère un rôle important du noyau dans la signalisation calcique et la mort cellulaire, se greffent des résultats qui montrent que ce processus de PCD met également en jeu la translocation de protéines du cytoplasme vers le noyau. Ainsi, au cours du développement des symptômes de mort cellulaire, nous avons récemment montré que la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) migre dans le noyau suite au traitement des cellules de tabac par les sphingolipides.
Les processus de translocation cytosol-noyau sont régis par des mécanismes complexes où les interactions protéines/protéines jouent un rôle important. Par exemple dans le domaine animal, en réponse à des signaux de mort, la GAPDH est nitrosylée sur une cystéine en position 153, ce qui provoque sa liaison à une ubiquitine E3 ligase (Siah) puis à la migration du complexe vers le noyau où Siah participe à la dégradation de protéines nucléaires (Sen et al. 2009; Yego and Mohr 2010; Ortiz-Ortiz et al. 2010).
Dans le domaine végétal, les données sont beaucoup moins abouties. Néanmoins, il a été montré que la GAPDH pouvait être nitrosylée comme chez les animaux (Holtgrefe et al. 2008), et de manière intéressante lors de la mise en place de la réaction hypersensible (HR) (Romero-Puertas et al. 2008). Ces résultats ont conduit des auteurs à proposer une intervention de la GAPDH dans les processus de mort cellulaire comme cela a déjà été décrit chez les animaux.
Le projet de stage visera à démontrer si dans la voie de signalisation des sphingolipides conduisant à la PCD, la GAPDH est nitrosylée et si cette nitrosylation est impliquée dans la translocation de la protéine vers le noyau. Cette étude nous conduira à identifier les partenaires protéiques de l’enzyme et à étudier leur rôle dans la translocation.

Le modèle biologique utilisé pour cette étude sera constitué de cellules de tabac BY-2. L’état de nitrosylation de la GAPDH en réponse aux sphingolipides sera évalué selon le protocole de « biotin-switch assay » maîtrisé au laboratoire. Les partenaires de l’enzyme seront identifiés par spectrométrie de masse LC-MS/MS, après immuno-précipitation de la GAPDH. Enfin, nous disposons dans l’équipe des constructions traductionnelles des gènes codant les GAPDHs de tabac en fusion avec la « Green Fluorescent Protein ». Ces constructions nous permettent de suivre par microscopie confocale la translocation de la GAPDH après expression de manière transitoire chez Nicotiana benthamiana. Les sites de nitrosylation présomptifs de la protéine seront modifiés par mutagénèse dirigée et l’impact de ces modifications sur sa translocation sera étudié.

Références bibliographiques

Holtgrefe S., Gohlke J., Starmann J., Druce S., Klocke S., Altmann B., Wojtera J., Lindermayr C. and Scheibe R. (2008). Regulation of plant cytosolic glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase isoforms by thiol modifications. Physiol. Plant. 133, 211-228.
Lachaud C., Da Silva D., Xiong T.C., Cotelle V., Thuleau P., Jauneau A., Brière C., Graziana A., Bellec Y., Faure J.D., Ranjeva R. and Mazars C. (2010). Nuclear calcium controls the apoptotic-like cell death induced D-erythro-sphinganine in tobacco cells. Cell Calcium 47, 92-100.
Ortiz-Ortiz M.A., Morán J.M., Ruiz-Mesa L.M., Bravo-San Pedro J.M. and Fuentes J.M. (2010) Paraquat exposure induces nuclear translocation of Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH) and the activation of the Nitric Oxide-GAPDH-Siah cell death cascade. Toxicol. Sci. 116, 614-622
Romero-Puertas M.C., Campostrini N., Mattè A., Righetti P.G., Perazzolli M., Zolla L., Roepstorff P. and Delledonne M. (2008). Proteomic analysis of S-nitrosylated proteins in Arabidopsis thaliana undergoing hypersensitive response. Proteomics 8, 1459-1469.
Sen N., Hara M.R., Ahmad A.S., Cascio M.B., Kamiya A., Ehmsen J.T., Agrawal N., Hester L., Doré S., Snyder S.H. and Sawa A. (2009). GOSPEL: a neuroprotective protein that binds to GAPDH upon S-nitrosylation. Neuron 63, 81-91.
Yego E.C. and Mohr S. (2010). Siah-1 Protein is necessary for high glucose-induced glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase nuclear accumulation and cell death in Muller cells. J. Biol. Chem. 29, 3181-3190.