- Stage:55 - Master 2 Recherche Biosciences Végétales

Stage:55

From Master 2 Recherche Biosciences Végétales

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Analyse moléculaire d’un état mutagène transitoire lors de l’évolution expérimentale d’une bactérie phyto-pathogène en symbiote de légumineuse


Laboratoire d'accueil : LIPM (Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes), Castanet-Tolosan
Equipe d'accueil : JBCM
Encadrant(e)(s) : Lena Tasse Cathérine Masson 05 61 28 54 49

Les rhizobia sont des micro-organismes d'intérêt majeur pour l'agriculture et l'environnement, grâce à leur capacité à entrer en symbiose avec des légumineuses et leur fournir des composés azotés issus de la fixation de l’azote atmosphérique. Ils sont un exemple frappant de bactéries phylogénétiquement très distantes qui ont pourtant une fonction biologique complexe en commun. La biodiversité des rhizobia et leur déterminisme génétique symbiotique soulève des questions fascinantes sur l'évolution de ces bactéries. De nombreuses preuves indiquent que le transfert horizontal de plasmides et/ou d’îlots symbiotiques a joué un rôle crucial dans l’évolution des rhizobia. Cependant, dans la plupart des cas la simple acquisition d’un plasmide symbiotique n’est pas suffisante pour permettre aux bénéficiaires de devenir symbiotiques, d’autres mécanismes d’adaptation (inconnus) sont nécessaires.
Afin de mettre en évidence ces mécanismes d’adaptation et de comprendre l’évolution des rhizobia, nous avons lancé un projet d’évolution expérimentale visant à convertir le pathogène Ralstonia solanacearum en symbiote de légumineuse. Pour cela, nous avons tout d’abord introduit le plasmide symbiotique d’un rhizobium dans le génome de R. solanacearum puis nous avons soumis la souche chimère résultante à la pression de sélection de la légumineuse Mimosa pudica (la Sensitive). Ainsi, nous avons obtenu des clones de Ralstonia évolués, capables de noduler Mimosa. Des passages répétés sur plantes ont ensuite permis l’amélioration constante des propriétés symbiotiques de ces clones nodulants (par exemple infection intracellulaire et compétitivité pour la nodulation). Les ancêtres, les clones finaux et certains clones intermédiaires ont été re-séquençés (Solexa/Illumina) et mappés sur le génome de référence
De façon inattendue, l'analyse des données de séquençage a révélé que le génome des clones évolués présente un nombre très élevé de mutations, accumulées lors de l'expérience d’évolution, ce qui peut expliquer la rapidité observée du processus d'évolution. Ce taux de mutations extrêmement élevé n’a pas été observé dans d’autres cas d’évolution expérimentale (réalisés avec E. coli par exemple) et est probablement le résultat d’un mécanisme unique et inconnu inhérent à notre système expérimental. Nous entreprenons maintenant la caractérisation de cet état mutagène transitoire.

Objectifs du stage :
1. Définition du compartiment mutagène (compartiments planctonique, rhizosphère et nodule) par le ré-séquençage haut-débit de populations reconstituées, suivi d’une estimation des fréquences relatives d’allèles. En parallèle, une détermination des fréquences d’apparition de mutants spontanément résistants à des antibiotiques sera effectuée dans les différents compartiments.
2. Détermination des gènes spécifiquement activés dans le compartiment mutagène par transcriptomique. Construction de fusions de certains de ces gènes avec le gène rapporteur GFP (Green Fluorescent Protein), suivi de l’étude de l’expression in vivo de ces gènes par microscopie de fluorescence.

Techniques:
Séquençage, extraction d’ARN, transcriptomique, PCR, clonages, microscopie de fluorescence, microbiologie, culture hydroponique des végétaux.