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Stage:74
From Master 2 Recherche Biosciences Végétales
Laboratoire d'accueil : Laboratoire de Recherche en Sciences Végétales (UMR5546 UPS/CNRS)
Equipe d'accueil : Protéines pariétales et développement et Peroxydases : évolution et expression
Encadrant(e)(s) : Vincent BURLAT, Prof UPS (05 34 32 38 55 ; burlat@lrsv.ups-tlse.fr), Christophe DUNAND, Prof UPS (05 34 32 38 57 ; dunand@lrsv.ups-tlse.fr), Valérie PACQUIT, MCU UPS (05 34 32 38 55 ; pacquit@scsv.ups-tlse.fr)
Les parois cellulaires végétales fixent dans leurs polymères (cellulose, lignines…) plus de 50% du carbone atmosphérique constituant ainsi une manne de carbone non alimentaire jusqu’alors largement sous exploitée pour la production de biocarburant de seconde génération (Carroll and Somerville, 2009). Cependant, la nature même des parois végétales, constituées de divers polymères étroitement inter-reliés, représente un obstacle majeur à leur accessibilité pour permettre leur conversion énergétique à un niveau industriel (Mansfied 2009). En dehors des divers polymères précités, les parois sont également constituées d’environ 5-10% de protéines représentant une diversité estimée de 2000 protéines dont environ ¼ sont aujourd’hui identifiées par des approches protéomiques (Irshad et al. 2008 ; Zhang et al. 2011) mais dont les fonctions restent à déterminer. Une meilleure connaissance fondamentale de la structure et de la nature dynamique des parois et des fonctions précises des protéines pariétales dans le dynamisme pariétal est donc indispensable.
Suite à la division cellulaire, la différenciation de certaines cellules végétales conduit à leur élongation, permettant ainsi la croissance de l’ensemble de l’organe. Le processus d’élongation cellulaire dépend de façon simplifiée de l’action opposée de la pression de turgescence et du relâchement pariétal (rupture des interactions entre certains polymères pariétaux) localisé dans certaines zones pariétales. Une fois l’élongation cellulaire terminée, un renforcement pariétal va venir structurer la cellule dans sa forme définitive (création de nouvelles liaisons covalentes entre polymères pariétaux). Enfin dans le cas des cellules spécialisées dans la conduction ou le support, une paroi secondaire est finalement synthétisée puis fortement renforcée et imperméabilisée par un processus de lignification.
L’implication de diverses peroxydases dans le relâchement pariétal (Passardi et al. 2006 ; Dunand et al. 2007), le renforcement pariétal (Schnabelrauch et al. 1996) et la lignification (Pedreira et al. 2011) a été proposée. L’absence fréquente d’observation de phénotype clair dans les analyses de mutants est probablement liée aux redondances fonctionnelles ou aux phénomènes de compensation car ces enzymes appartiennent à une famille multigénique (73 membres chez Arabidopsis thaliana). De nombreuses peroxydases sont capables de réaliser un même type de réaction in vitro (exemple de la polymérisation des lignines de synthèse in vitro), c’est donc la coexistence in vivo du substrat et de son enzyme qui confère la spécificité de réaction. La définition du profil spatio-temporel d’expression de gènes de peroxydases candidates et la localisation sub-cellulaire des protéines correspondantes est donc indispensable à leur analyse fonctionnelle.
Le projet utilisera la plante modèle Arabidopsis thaliana et les résultats escomptés sont :
(i) l’analyse systématique des profils d’expression spatio-temporelle spécifique d’une 15aine de gène de peroxydases pariétales (préalablement identifiées par des études protéomiques) pour déterminer les candidats potentiellement impliqués respectivement dans le relâchement pariétal, le renforcement pariétal ou la lignification. La technique de choix retenue est l’hybridation d’ARN in situ (Burlat et al. 2004; Guirimand et al. 2010).
(ii) la localisation subcellulaire fine au niveau des parois pour les candidats retenus en (i). Pour cela, il faudra construire des plasmides d’expression des protéines candidates en fusion avec la GFP (clonages Gateway).
(iii) une contribution au génotypage et au phénotypage de mutants d’insertions simples, et génération de mutants multiples (croisement de mutants d’insertion simples ou ARN interférentiel ciblé sur des clusters de gènes co-exprimés) pour les gènes identifiés en (i) et en (ii).
Techniques :
Biologie moléculaire : techniques de biologie moléculaire classique concernant l'ADN et l'ARN, clonage, séquençage et analyse / comparaison des séquences, transcription in vitro de ribosondes marquées à la digoxygénine
Microbiologie : transformation et culture de bactéries
Biologie cellulaire et Imagerie : histologie, microtomie, hybridation d’ARN in situ, microscopie optique en champ clair, transgenèse par Agroinfiltration, imagerie GFP, microscopie en epifluorescence et confocale.
Bibliographie :
Burlat V, Oudin A, Courtois M, Rideau M, St-Pierre B (2004). Co-expression of three MEP pathway genes and geraniol 10-hydroxylase in internal phloem parenchyma of Catharanthus roseus implicates multicellular translocation of intermediates during the biosynthesis of monoterpene indole alkaloids and isoprenoid-derived primary metabolites. Plant J. 38: 131-141.
Carroll A and Somerville C. (2009). Cellulosic biofuels. Ann. Rev. Plant Biol. 60: 165-182.
Dunand C, Crevecoeur M, Penel C (2007). Distribution of superoxide and hydrogen peroxide in Arabidopsis root and their influence on root development: possible interaction with peroxidases. New Phytol. 174: 332-341.
Guirimand G, Courdavault V, Lanoue A, Mahroug S, Guihur A, Blanc N, Giglioli-Guivarc’h N, St-Pierre N, Burlat V (2010). Strictosidine activation in Apocynaceae: towards a "nuclear time bomb"? BMC Plant Biol. 10:182.
Irshad M, Canut H, Borderies G, Pont-Lezica R, Jamet E (2008). A new picture of cell wall protein dynamics in elongating cells of Arabidopsis thaliana: confirmed actors and newcomers. BMC Plant Biol. 8: 94.
Mansfield SD (2009). Solutions for dissolution-engineering cell walls for deconstruction. Curr. Opin. Biotechnol. 20: 286-294.
Passardi F, Tognolli M, De Meyer M, Penel C, Dunand C (2006). Two cell wall associated peroxidases from Arabidopsis influence root elongation. Planta 223: 965-974.
Pedreira J, Herrera MT, Zarra I, Revilla G (2011). The overexpression of AtPrx37, an apoplastic peroxidase, reduces growth in Arabidopsis. Physiol. Plant. 141: 177-187.
Schnabelrauch LS, Kieliszewski M, Upham BL, Alizedeh H, Lamport DTA (1996). Isolation of pl 4.6 extensin peroxidase from tomato cell suspension cultures and identification of Val—Tyr—Lys as putative intermolecular cross-link site. Plant J. 9: 477-489.
Zhang Y, Giboulot A, Zivy M, Valot B, Jamet E, Albenne C (2011). Combining various strategies to increase the coverage of the plant cell wall glycoproteome. Phytochemistry 72: 1109-1123.