- Stage:79 - Master 2 Recherche Biosciences Végétales

Stage:79

From Master 2 Recherche Biosciences Végétales

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Etude d’une protéine kinase calcium-dépendante impliquée dans la mort cellulaire induite par les sphingolipides chez les végétaux


Laboratoire d'accueil : UMR UPS-CNRS 5546 Laboratoire de Recherche en Sciences Végétales (LRSV)
Equipe d'accueil : Signalisation calcique cytosolique et nucléaire chez les végétaux (responsable : C.Mazars)
Encadrant(e)(s) : Valérie Cotelle, McF Université Paul Sabatier (cotelle@lrsv.ups-tlse.fr, tél : 05 34 32 38 06)

Chez les plantes, la mort cellulaire programmée (PCD) intervient dans les processus de développement et de différenciation ainsi que dans les réactions de défense contre des agents pathogènes. Récemment, il a été montré que les Long Chain Bases (LCBs), qui constituent l’élément de base des sphingolipides, jouent un rôle important dans la mise en place de la PCD induite par des pathogènes chez les végétaux. Ainsi, la fumonisine B1 (FB1), une toxine analogue de LCB produite par le champignon nécrotrophe Fusarium moniliforme, conduit à la PCD des cellules infectées via l’accumulation de la dihydrosphingosine (DHS) et de la phytosphingosine (PHS), les deux LCBs majoritaires chez les plantes (Saucedo-García et al., 2011). Néanmoins, peu de données sur le mode d’action de ces lipides sont à ce jour disponibles et les travaux de l’équipe d’accueil visent à caractériser la voie de signalisation des LCBs conduisant à la PCD chez les végétaux et sa régulation par le calcium. Dans ce contexte, nous avons mis en évidence le rôle prépondérant joué par le calcium (Ca2+) nucléaire (Lachaud et al., 2010; 2011) et montré que la PHS induit la phosphorylation des protéines 14-3-3s. Cette phosphorylation peut être catalysée par une protéine kinase Ca2+-dépendante (CPK), qui est elle-même une cible des 14-3-3s. De plus, la phosphorylation des 14-3-3s induite par la PHS est corrélée à leur perte d’interaction avec la CPK (Lachaud et al., manuscrit en préparation). Des expériences préliminaires semblent également indiquer que la dissociation de ce complexe est accompagnée d’une protéolyse de la CPK et de sa relocalisation dans le noyau. Enfin, nous avons récemment démontré que cette CPK est un régulateur positif de la PCD induite par FB1.

Dans le but de caractériser les mécanismes d’action de la CPK, l’objectif du présent projet sera d’étudier sa régulation par les 14-3-3s en relation avec la mort cellulaire induite par la PHS ou FB1 chez Arabidopsis thaliana. Ainsi, un des premiers objectifs sera de déterminer avec quelles isoformes de 14-3-3s la CPK interagit. Pour cela, la CPK sera immunoprécipitée et les 14-3-3s associées seront identifiées par une approche protéomique. La validation des interactions sera effectuée in planta par la technique de FRET-FLIM qui sera également utilisée pour étudier la localisation subcellulaire des partenaires. En parallèle, la préparation de noyaux purifiés ou de fractions nucléaires enrichies sera mise au point afin de détecter la présence éventuelle de la CPK endogène dans le noyau par une approche biochimique. Si sa localisation nucléaire est avérée, ses partenaires protéiques seront recherchés en utilisant une approche protéomique après immunopréciptation de la CPK. Enfin, le rôle de l’interaction avec les 14-3-3s sur la localisation et la stabilité de la CPK sera testé par co-expression transitoire in planta des 14-3-3s et de la CPK sauvage ou mutée dans son site d’interaction aux 14-3-3s.

Le projet proposé, qui implique l’utilisation de diverses techniques (biologie cellulaire, biochimie des protéines, biologie moléculaire, microscopie), devrait permettre l’identification de nouveaux acteurs et processus intervenant dans la mort cellulaire dépendante des LCBs chez les plantes, qui feront par la suite l’objet d’une caractérisation approfondie dans le cadre d’un projet de thèse.

Références

Lachaud, C., Da Silva, D., Cotelle, V., Thuleau, P., Xiong, T.C., Jauneau, A., Brière, C., Graziana, A., Bellec, Y., Faure, J.D., Ranjeva, R., and Mazars, C. (2010). Nuclear calcium controls the apoptotic-like cell death induced by D-erythro-sphinganine in tobacco cells. Cell Calcium 47, 92-100.

Lachaud, C., Da Silva, D., Amelot, N., Béziat, C., Brière, C., Cotelle, V., Graziana, A., Grat, S., Mazars, C., and Thuleau, P. (2011). Dihydrosphingosine-induced programmed cell death in tobacco BY-2 cells is independent of H2O2 production. Mol. Plant 4, 310-318.

Saucedo-García, M., Guevara-García, A., González-Solís, A., Cruz-García, F., Vázquez-Santana, S., Markham, J.E., Lozano-Rosas, M.G., Dietrich, C.R., Ramos-Vega, M., Cahoon, E.B., and Gavilanes-Ruíz, M. (2011). MPK6, sphinganine and the LCB2a gene from serine palmitoyltransferase are required in the signaling pathway that mediates cell death induced by long chain bases in Arabidopsis. New Phytol. 191, 943-957.