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Stage:8
From Master 2 Recherche Biosciences Végétales
Laboratoire d'accueil : Symbiose et Pathologie des Plantes (SP2, INP-ENSAT)
Equipe d'accueil :
Encadrant(e)(s) : Cécile BEN /ben@ensat.fr / tel: 05 62 19 35 92,
Les microARN sont une famille de petits ARN non codants (~ 21 nt) d’origine endogène qui régulent l’expression génique au niveau post-transcriptionnel (par dégradation de l’ARNm cible ou blocage direct ou indirect de la traduction) en se fixant à des séquences complémentaires cibles d’ARNm. Chez Arabidopsis thaliana, des études ont montré que les miARN sont impliqués dans divers processus biologiques clés tels que le développement, la transduction du signal hormonal ou encore la réponse aux stress (revue :Zhang et al., 2006). Quelques rapports récents indiquent également que les miARN sont impliqués dans les interactions avec divers microorganismes pathogènes (Navarro et al., 2006 ; Navarro et al., 2008) mais le rôle de ces riborégulateurs dans les voies de défense contre des bactéries et champignons est encore mal connu.
Les Légumineuses présentent l'avantage unique de permettre la comparaison simultanée et sur la même plante des mécanismes de régulations mis en oeuvre lors de la réponse aux pathogènes et lors de la réponse symbiotique. Les outils génomiques et bioinformatiques développés chez la plante modèle des légumineuses Medicago truncatula sont utilisés depuis peu de temps pour l’étude de phénomènes de régulation post-transcriptionnelle par les microARNs. Des analyses bioinformatiques ont permis de prédire des nouveaux miRNAs et des cibles potentielles chez M. truncatula (Zhou et al., 2008 ; Wen et al., 2008).
Le projet de recherche que nous proposons vise à étudier le rôle de microARNs d'intérêt dans la régulation post-transcriptionnelle des voies de défense de Medicago truncatula contre la bactérie pathogène Ralstonia solanacearum responsable du flétrissement bactérien chez plus de 200 espèces végétales.
Si des études génétiques, génomiques et cytologiques sont menées actuellement pour tenter de comprendre le déterminisme génétique de la résistance de la légumineuse modèle contre cette bactérie pathogène racinaire ainsi que les mécanismes cellulaires de l'infection, aucune donnée concernant leur contrôle au niveau post-transcriptionnel par les miRNA n'est à ce jour disponible. Plus généralement, les données fournies par ce projet permettront de mieux comprendre le rôle des miRNA chez les plantes lors d’interactions biotiques pathogènes.
Ce sujet s’appuie sur le projet Génoscope « MIRMED » qui a pour objectif d'établir un catalogue de miARN chez M. truncatula impliqués dans les réponses aux microorganismes et aux stress abiotiques, par une approche expérimentale et un séquençage systématique et à haut débit par la technologie Solexa. Dans le cadre de ce projet, des banques de miARN de Medicago truncatula induits en réponse à la bactérie pathogène Ralstonia solanacearum dans le cas d'une interaction compatible et incompatible ont été produites dans notre laboratoire et séquencées. Une analyse bioinformatique comparée des séquences des banques de miRNA a permis d'identifier des gènes de microARN différentiellement exprimés dans les interactions étudiées. Les cibles potentielles de ces microARNs ont été prédites in silico par recherche d'homologie entre le miRNA mature et la séquence dans l’ARN cible.
Les objectifs spécifiques du projet de M2R et les travaux afférents sont :
Etape 1: Identification de microARN jouant potentiellement des rôles clés dans la modulation des voies de défense de Medicago truncatula contre la bactérie pathogène Ralstonia solanacearum.
Afin de valider expérimentalement les résultats obtenus in silico, les données des analyses bioinformatiques seront confrontées à des données d'expression de gène du microARN et de sa cible potentielle dans les interactions compatible et incompatible. Cette étude sera réalisée grâce à des expériences de RT-PCR quantitative ou par analyses d’hybridation northern. Pour un gène régulé par un miR par dégradation de l'ARNm, on s’attend à un patron d’expression opposé, c.à.d. quand le miRNA est fortement exprimé, le taux d’expression de la cible est diminué et inversement.
Etape 2: Validation fonctionnelle de quelques couples microARN/ARNm cible d'intérêt.
Pour un couple microARN/ARNm cible d'intérêt particulier, nous procéderons à une étude approfondie de leur fonction biologique. Pour cette validation fonctionnelle, des plantes composites seront créées par transformation des racines avec Agrobacterium rhizogenes portant une construction permettant la surexpression du miRNA ou sa sous-expression par RNAi ou bien permettant l’expression d’une forme mutée de la cible insensible à l’inhibition par le miRNA. La réponse de ces plantes à Ralstonia solanacearum sera étudiée (phénotypes, expression de gènes marqueurs de défense et du gène cible putatif).
Navarro et al. 2006. Science 313, 436 - 439
Navarro et al. 2008. Science 321, 964-967.
Wen et al. 2008. In silico Biol. 8, online
Zhou et al. 2008. Biochem. Biophys. Res. Comm. 374, 538-542.
Zhang et al. 2006. Devel. Biol. 289, 3-16.