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Stage:90
From Master 2 Recherche Biosciences Végétales
Laboratoire d'accueil : Laboratoire de Recherche en Sciences Végétales, UMR CNRS-UPS 5546
Equipe d'accueil : Signalisation calcique cytosolique et nucléaire chez les végétaux. Responsable : Christian Mazars
Encadrant(e)(s) : Patrice Thuleau CR1 CNRS, thuleau@lrsv.ups-tlse.fr, Tel. 05 34 32 38 06
Chez les plantes, il est aujourd’hui établi que la mort cellulaire programmée (PCD) intervient aussi bien dans les processus de développement et de différenciation que dans les réactions de défense contre des agents pathogènes. Néanmoins, contrairement à ce qui est connu chez les animaux, les mécanismes de mort cellulaire chez les plantes sont encore mal élucidés. Au laboratoire, nous avons récemment montré que certains sphingolipides provoquent une PCD de cellules de tabac BY-2 et induisent, au préalable, une augmentation d’espèces activées de l’oxygène (ROS) ainsi que des variations calciques cytosolique et nucléaire (Lachaud et al. 2010 ; Lachaud et al. 2011). De manière intéressante, si les variations de calcium nucléaire sont spécifiquement inhibées, la PCD induite pas les sphingolipides est bloquée (Lachaud et al. 2010). A cette première série de données, qui suggère un rôle important du noyau dans la mise en place des processus de mort cellulaire, se greffent des résultats qui montrent que ce processus de PCD met également en jeu la translocation de protéines du cytoplasme vers le noyau. Ainsi, au cours du développement des symptômes de mort cellulaire, nous avons récemment montré que la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) migre dans le noyau suite au traitement des cellules de tabac par les sphingolipides. Cette translocation de la GAPDH est régulée par le monoxyde d’azote qui serait à l’origine de la nitrosylation de la protéine dans le cytosol et de sa migration dans le noyau (Da Silva, 2010 ; Da Silva et al. 2011).
Le projet de stage visera à étudier plus en détail le rôle de la nitrosylation de la GAPDH et d’une manière plus générale à caractériser la fonction de la protéine une fois qu’elle a migré dans le noyau. En particulier, on peut émettre l’hypothèse que la nitosylation de la GAPDH provoque son association avec d’autres protéines dans le compartiment cytosolique pour aider à sa translocation, comme cela a été démontré dans le domaine animal (Hara et al. 2006). Par ailleurs, toujours par référence au domaine animal (Kornberg et al. 2010), on peut penser que dans le compartiment nucléaire, la GAPDH pourrait trans-nitrosylée d’autre protéines comme des histone déacétylases afin d’assurer sa fonction.
Le modèle biologique utilisé pour cette étude sera constitué de cellules de tabac BY-2. L’état de nitrosylation de la GAPDH ou des protéines nucléaires en réponse aux sphingolipides sera évalué selon le protocole de « biotin-switch assay » maîtrisé au laboratoire. Les partenaires de l’enzyme seront identifiés par spectrométrie de masse LC-MS/MS, après immuno-précipitation de la GAPDH. Enfin, nous disposons dans l’équipe des constructions traductionnelles des gènes codant les GAPDHs de tabac en fusion avec la « Green Fluorescent Protein ». Ces constructions nous permettront de suivre par microscopie confocale la translocation de la GAPDH soit après expression transitoire chez Nicotiana benthamiana soit après une transformation stable des cellules de tabac. Les sites de nitrosylation présomptifs de la protéine seront modifiés par mutagénèse dirigée et l’impact de ces modifications sur sa translocation ou sur son activité sera étudié.
Références
Da Silva D. (2011). Rôle du compartiment nucléaire dans la signalisation conduisant à la mort cellulaire en réponse aux sphingolipides chez les cellules de tabac BY-2. Thèse de l’Université de Toulouse.
Da Silva D., Lachaud C., Cotelle V., Brière C., Grat S., Mazars C., Thuleau P. (2011). Nitric oxide production is not required for dihydrosphingosine-induced cell death in tobacco BY-2 cells. Plant Signal Behav 6, 736-739.
Hara M.R. and Snyder S.H. (2006). Nitric oxide-GAPDH-Siah: a novel cell death cascade. Cell. Mol. Neurobiol. 26, 527-538.
Kornberg M.D., Sen N., Hara M.R., Juluri K.R., Nguyen J.V., Snowman A.M., Law L., Hester L.D., Snyder S.H. (2010) GAPDH mediates nitrosylation of nuclear proteins. Nat Cell Biol 12, 1094-1100.
Lachaud C., Da Silva D., Amelot N., Béziat C., Brière C., Cotelle V., Graziana A., Grat S., Mazars C., Thuleau P. (2011). Dihydrosphingosine-induced programmed cell death in tobacco BY-2 cells is independent of H2O2 production. Mol Plant 4, 310-318.
Lachaud C., Da Silva D., Xiong T.C., Cotelle V., Thuleau P., Jauneau A., Brière C., Graziana A., Bellec Y., Faure J.D., Ranjeva R. and Mazars C. (2010). Nuclear calcium controls the apoptotic-like cell death induced D-erythro-sphinganine in tobacco cells. Cell Calcium 47, 92-100.