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Stage:117
From Master 2 Recherche Biosciences Végétales
Laboratoire d'accueil : Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes UMR CNRS-INRA 2594/441, BP52627, 31326 Castanet-Tolosan
Equipe d'accueil : Signaux symbiotiques et leur perception/transduction (Clare Gough/Julie Cullimore)
Encadrant(e)(s) : Christine Hervé email: Christine.Herve@toulouse.inra.fr; tel: 05 61 28 53 22
De nombreuses plantes terrestres pour assurer leur croissance vivent en symbiose avec des champignons et plus rarement avec des bactéries. Les légumineuses s’associent à la fois avec des bactéries du sol du type Rhizobium qui fixent l’azote atmosphérique au sein d’organes spécifiques qui se forment sur les racines, les nodules et des champignons endomycorhiziens à arbuscules (AM). L’établissement de ces symbioses nécessite un véritable dialogue moléculaire entre les partenaires. Les microorganismes produisent des signaux symbiotiques de type lipochitooligosaccharidiques (LCO) perçus par la plante et nécessaires à la mise en place des processus symbiotiques (Lerouge et al., 1990; Gough and Cullimore, 2011; Maillet et al., 2011). Par des approches génétiques, des gènes de légumineuses impliqués dans la perception et la transduction de ces signaux ont été identifiés (Oldroyd and Downie, 2008). Plusieurs d’entre eux codent des protéines transmembranaires ayant une structure similaire à un récepteur (DMI2, LYK3, NFP). Des criblages double-hybride chez la levure ont permis d’isoler un partenaire commun des récepteurs DMI2 et LYK3, une E3 ubiquitine ligase appelée MtPUB1 (Medicago truncatula Plant Ubox protein) (Mbengue et al., 2010). MtPUB1, est induit précocement en réponse aux LCO et joue un rôle négatif dans la nodulation et la mycorhization (Mbengue et et al. 2010 et Hervé et al., non publié). MtPUB1 présente une activité d’auto-ubiquitination in vitro (Mbengue et al., 2010). De plus, il a été montré que chez une lignée mutante ayant perdue l’activité ubiquitine ligase de MtPUB1 la régulation réalisée par MtPUB1 n’est plus effective. Des données récentes obtenues dans le groupe par spectrométrie de masse ont permis d’identifier plusieurs sites de phosphorylation sur MtPUB1 après phosphorylation in vitro par les domaines kinase de DMI2 et LYK3.
L’objectif de ce stage sera de déterminer les conséquences des modifications post-traductionnelles détectées chez MtPUB1 sur son activité et ses capacités d’interactions.
1- Une activité d’auto-ubiquitination a été détectée in vitro, nous rechercherons cette activité in planta et la conséquence sur MtPUB1 (stabilité de la protéine, localisation sub-cellulaire). Des lignées stables de Medicago truncatula exprimant la protéine MtPUB1 étiquetée permettront de tester différentes conditions symbiotiques. Les expériences in vitro et dans N. benthamiana suggèrent que le récepteur symbiotique LYK3 n’est pas un substrat de MtPUB1 (Mbengue et al., 2010). Par une approche double hybride chez la levure, des substrats de MtPUB1 seront recherchés et testés in vitro pour leur ubiquitination par MtPUB1.
2- Les protéines recombinantes fonctionnelles de MtPUB1 produites chez E. coli assurent leur propre ubiquitination in vitro suggérant que la phosphorylation par les récepteurs n’est pas nécessaire pour l’auto-ubiquitination. Inversement, la phosphorylation de certains sites pourrait réguler négativement l’activité ubiquitine ligase de MtPUB1. Cette hypothèse sera testée par mutagénèse de deux sites de phosphorylation présents dans le domaine U-box de MtPUB1 en sites mimant des phosphorylations. Les protéines modifiées seront produites chez E. coli, purifiées et leur activité d’auto-ubiquitination sera testée. La phosphorylation de MtPUB1 pourrait également avoir un impact négatif sur l’interaction avec ses partenaires. Cette hypothèse sera évaluée dans la levure par un système double hybride. L’interaction entre les domaines kinase des récepteurs DMI2 et LYK3 et MtPUB1dont des acides aminés auront été modifiés pour mimer des phosphorylations dans la région essentielle à l’interaction avec DMI2 et LYK3 sera testée.
L’ensemble des résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels MtPUB1 régule des processus symbiotiques.
Techniques utilisées
Clonage, mutagénèse dirigée, production de protéine recombinante chez E. coli, ubiquitination in vitro, Western blot, immunoprécipitation, double hybride chez la levure
Références bibliographiques
Lerouge P, Roche P, Faucher C, Maillet F, Truchet G, Promé JC, Dénarié J (1990) Symbiotic host-specificity of Rhizobium meliloti is determined by a sulphated and acylated glucosamine oligosaccharide signal. Nature 19: 781-784.
Gough C, Cullimore J (2011) Lipo-chitooligosaccharide signaling in endosymbiotic plant-microbe interactions. Mol Plant Microbe Interacts, 24: 867-878.
Oldroyd GED and Downie JA (2008). Coordinating nodule organogenesis with rhizobial infection in legumes. Annu. Rev. Plant Biol. 59:519-546.
Mbengue M., Camut S., de Carvalho-Niebel F, Deslandes L., Froidure S., Klaus D., Moreau S., Rivas S., Hervé C., Cullimore J., and Lefebvre B. (2010). The Medicago truncatula E3 ubiquitin ligase, MtPUB1, interacts with the LYK3 symbiotic receptor and negatively regulates nodulation. The Plant Cell, 22: 1-16.
Maillet F, Poinsot V, André O, Puech-Pagès V, Haouy A, Gueunier M, Cromer L, Giraudet D, Formey D, Niebel A, Martinez EA, Driguez H, Bécard G, Dénarié J. (2011) Fungal lipochitooligosaccharide symbiotic signals in arbuscular mycorrhiza. Nature 469: 58-63.