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Stage:13
From Master 2 Recherche Biosciences Végétales
Laboratoire d'accueil : Surfaces Cellulaires et Signalisation chez les Végétaux (UMR UPS-CNRS 5546)
Equipe d'accueil : Signalisation calcique cytosolique et nucléaire chez les végétaux (responsable : C.Mazars)
Encadrant(e)(s) : Valérie Cotelle (MCF Université Paul Sabatier) cotelle@scsv.ups-tlse.fr, tél : 05 62 19 35 06 Michel Rossignol (IR CNRS plateforme protéomique IFR40 IPBS) michel.rossignol@ipbs.fr, tél : 05 61 17 55 33
Les voies de biosynthèse et de signalisation des sphingolipides sont depuis plusieurs années très étudiées dans le domaine animal, en raison du rôle joué par ces lipides dans le contrôle de l’homéostasie cellulaire. Chez les végétaux, ces molécules suscitent un intérêt grandissant. En effet, des travaux récents montrent l’implication des sphingolipides dans la signalisation cellulaire en réponse au stress hydrique ou dans la mort cellulaire. Néanmoins, peu de données sur le rôle et le mode d’action de ces lipides sont à ce jour disponibles. Dans ce contexte, les travaux menés dans l’équipe d’accueil visent à caractériser les voies de signalisation impliquées dans les processus de mort cellulaire induits chez les plantes par les sphingolipides. Ainsi, en utilisant des cultures cellulaires de tabac, nous avons pu mettre en évidence le rôle prépondérant du calcium (Ca2+) nucléaire dans l’induction de la mort cellulaire par les sphingolipides. Des études complémentaires ont permis de caractériser cette mort cellulaire calcium-dépendante qui est de type apoptotique (Lachaud et al., 2009). De plus, des modifications des protéines 14-3-3 ou de leurs protéines cibles ont été observées en réponse au DHS, un sphingolipide de la classe des « long chain bases » (LCBs). Il semblerait donc que les protéines 14-3-3s et leurs protéines cibles puissent jouer un rôle important dans le processus de mort cellulaire induit par les sphingolipides chez les végétaux, comme cela est déjà connu dans le domaine animal. En effet, chez des fibroblastes, il a été montré que certains LCBs activent une protéine kinase capable de phosphoryler certaines isoformes de 14-3-3s au niveau d’un résidu sérine situé dans leur domaine de dimérisation (Megidish et al., 1998). Cette phosphorylation conduit à la libération de protéines pro-apoptotiques (séquestrées par les dimères de 14-3-3s) qui vont ensuite déclencher la mort cellulaire programmée (Borner, 2003).
Les travaux proposés auront pour objectif d’identifier, par une approche protéomique, les protéines cibles des 14-3-3s potentiellement impliquées dans la mort cellulaire induite par les sphingolipides chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, en mettant en œuvre le programme de travail suivant :
1- Modèle d’étude
Des études préliminaires ont montré que le DHS induit chez Arabidopsis thaliana, comme chez le tabac, une mort cellulaire. Afin de faciliter et de rendre plus efficaces les études protéomiques par spectrométrie de masse, les cellules d’Arabidopsis dont le génome est séquencé, seront choisies comme modèle biologique expérimental.
2- Caractérisation de la mort cellulaire induite par le DHS chez les cellules d’Arabidopsis thaliana
Une étude précise de la cinétique de mort cellulaire induite par le DHS sera réalisée chez Arabidopsis. En parallèle, les modifications par le DHS du profil d’interaction protéines cibles/14-3-3s seront analysées par overlay aux 14-3-3s. Les résultats obtenus permettront de préciser les conditions de traitement par le DHS à retenir pour la suite du travail.
3- Identification des protéines dont la capacité d’interaction avec les 14-3-3s est modifiée par le DHS
Les cellules d’Arabidopsis seront incubées en présence ou non de DHS, puis un enrichissement des extraits protéiques en protéines cibles des 14-3-3s sera réalisé par chromatographie d’affinité (Cotelle et al., 2000). Après séparation par électrophorèse monodimensionnelle, les protéines issues des échantillons témoin et essai seront identifiées par spectrométrie de masse en tandem LC-MS/MS faisant intervenir une chaîne de nano-HPLC et un spectromètre de type Orbitrap (collaboration avec la plateforme protéomique toulousaine). Après validation et traitement informatique des résultats analytiques, les protéines différentiellement présentes dans les situations témoin et essai seront confirmées par une étude avec les anticorps existants dirigés contre ces protéines dans des expériences de western blot. De plus, dans des expériences d’immunoprécipitation croisées avec des anticorps anti-14-3-3s, ces anticorps pourront permettre de vérifier la modification in vivo par le DHS de l’interaction de ces cibles avec les 14-3-3s.
Le projet proposé devrait permettre, par une approche biochimique, l’identification de nouveaux acteurs intervenant dans la mort cellulaire induite par les sphingolipides chez les plantes, qui feront par la suite l’objet d’une caractérisation approfondie dans le cadre d’un projet de thèse.
Références :
Borner C. (2003). The Bcl-2 protein family: sensors and checkpoints for life-or-death decisions. Mol. Immunol. 39: 615-647.
Cotelle V., Meek S.E.M., Provan F., Milne F.C., Morrice N. and MacKintosh C. (2000). 14-3-3s regulate global cleavage of their diverse binding partners in sugar-starved Arabidopsis cells. EMBO J. 19: 2869-2876.
Lachaud C., Da Silva D., Cotelle V., Thuleau P., Xiong TC, Jauneau A., Brière C., Graziana A., Bellec Y., Faure JD, Ranjeva R. and Mazars C. (2009). Increase in free nuclear calcium is required for the apoptotic-like cell death induced by D-erythro-sphinganine in tobacco cells. Plant Physiol., soumis.
Megidish T., Cooper J., Zhang L., Fu H. and Hakomori S. (1998). A novel sphingosine-dependent protein kinase (SDK1) specifically phosphorylates certain isoforms of 14-3-3 protein. J. Biol. Chem., 273: 21834-45.