Stage:130

From Master 2 Recherche Biosciences Végétales

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Analyse de la contribution de PRR2, un facteur de transcription, dans les réactions de défense chez les plantes

Laboratoire d'accueil : Laboratoire LRSV
Equipe d'accueil : Signalisation calcique cytosolique et nucléaire chez les végétaux
Encadrant(e)(s) : D. Aldon (05-34-38-43) aldon@lrsv.ups-tlse.fr

Sujet :
Les travaux de l’équipe d’accueil ont caractérisé un senseur calcium appartenant à une famille spécifiquement rencontrée chez les plantes, CML9 (Calmodulin-Like protein 9). Des analyses fonctionnelles basées sur des approches perte /gain de fonction ont permis d’établir que cette CML est impliquée dans les réponses des plantes aux agressions biotiques et abiotiques de l’environnement (1,2). A l’issue d’un criblage sans a priori, plusieurs partenaires de CML9 ont été identifiés et une étude plus approfondie a été engagée sur PRR2 un facteur de transcription (FT) potentiel.
PRR2 est une protéine de « fonction inconnue » spécifique au règne végétal. La présence de différents domaines/motifs prédits dans la séquence de PRR2 dont un domaine GARP de liaison à l’ADN suggère un rôle de facteur de transcription pour cette protéine (4). L’approche de génétique inverse réalisée par C. Cheval (Thèse en cours) a permis d’établir que PRR2 constitue un régulateur positif des défenses à une souche virulente de Pseudomonas syringae (Pst DC3000). En effet, des lignées sur-exprimant ce gène (OE-PRR2s) présentent une réduction de sensibilité très significative lors d’une inoculation par cette bactérie phytopathogène.
Compte tenu de ces résultats, une attention particulière a été apportée à l’acide salicylique (SA), hormone clé de la coordination des défenses à Pst. Des dosages de SA ont été réalisés dans les différents génotypes en réponse à Pst DC3OOO en collaboration avec le groupe d’A. Mithoefer (Max Planck Iéna). Une teneur significativement plus élevée de SA dans les lignées OE-PRR2s a été montrée. Ces résultats sont cohérents avec les phénotypes des lignées OE-PRR2s à Pst. La modulation du niveau d’expression de PRR2 (WT vs mutant KD vs OE) semblent « potentialiser » la production de SA après infection puisqu’en situation témoin aucune différence significative n’est observée. De façon complémentaire, un dosage de camalexine, une phytoalexine majoritairement présente chez A. thaliana, a été réalisé. Les résultats obtenus montrent une accumulation de ce composé dès 24h après inoculation de plantes WT (Col) et une hyper accumulation (2 à 6 fois) dans les OE-PRR2s. A l’inverse, des mutants Knock-down prr2.1 ou RNAi présentent un niveau plus faible de camalexine indiquant une bonne corrélation entre le gain ou la perte partielle de fonction de PRR2 et un effet physiologique associé à la défense (Cheval et al, en préparation).
Pour mieux évaluer le niveau de contribution de PRR2 dans les réactions de défense à Pseudomonas syringae, le comportement des lignées prr2-1 et OE-PPR2 a été analysé en réponse à une inoculation par une souche Pst DC3000 hrcC-, incapable d’injecter des effecteurs dans les cellules hôtes. Dans ces conditions, les lignées KDprr2-1 se caractérisent par une plus faible susceptibilité suggérant que les réponses des lignées prr2 à Pst DC3000 sont effecteurs-dépendantes.

Projet
Les analyses effectuées jusqu’à présent indiquent que PRR2 agit dans des voies associées au SA. Dans la cadre du projet de M2R, il s’agira de préciser et valider ce positionnement en utilisant des outils génétiques actuellement en cours de caractérisation (croisements entre des mutants de signalisation/production de la voie SA et les génotypes prr2). Dans ce but, différents marqueurs cellulaires (détection de callose, …), moléculaires (gènes associés à différentes voies dont celles du SA) ou biochimiques (détection protéine PR1) des défenses seront étudiés dans un contexte normal ou pathologique dans les lignées disponibles.
Dans la mesure ou PRR2 pourrait contrecarrer l’action d’effecteurs bactériens, dans le cadre du projet M2R, différentes souches de Pst délétées d’effecteurs seront testées en utilisant le pathosystème Pst DC3000-plantules d’Arabidopsis (Ishiga et al., 2011). Ces expériences permettront de préciser le /les effecteurs associés à l’observation des phénotypes dans les génotypes prr2. Pst DC3000 constituant un pathogène de référence, l’identification des effecteurs impliqués, pourrait permettre une meilleure compréhension des processus cellulaires contrôlés par PRR2 dans le contexte des réactions de défense.

Approches expérimentales :
Caractérisation et utilisation d’outils génétiques (double –mutants prr2-mutants de production ou de signalisation SA …)
Tests de sensibilité à un agent pathogène (P. syringae)
- Quantification de la croissance bactérienne in planta (IGC)
Analyse de marqueurs moléculaires et cellulaires associés à la défense
- Approches de RT-QPCR classique et technologie Fluidigm
- Détection et quantification de la mise en place de papilles de callose (microscopie à fluorescence après coloration au bleu d’aniline)

Références :
(1) Magnan F., Charpenteau M., Sotta B., Ranty B., Galaud J.P., Aldon D. (2008) Mutations in AtCML9, a CaM-like protein from Arabidopsis thaliana, alters plant responses to abiotic stress and ABA. Plant J., 56 : 575-589.
(2) Leba L.J., Cheval C., Ortiz-Martin I., Ranty B., Beuzon C., Galaud J.P., Aldon D. (2012) CML9, an Arabidopsis calmodulin-like protein, contributes to plant innate immunity through a flagellin-dependent signaling pathway. Plant J. (in press)
(3) Leba L.J., Perochon A., Cheval C., Ranty B., Galaud J.P., Aldon D., 2012. CML9, a multifunctional Arabidopsis thaliana calmodulin-like protein involved in stress responses and plant growth? Plant Signaling & Behavior (sous presse)
(4) Perochon A., Aldon A., Galaud J.P., Ranty B., 2011. Calmodulin and calmodulin-like proteins in plant calcium signalling. Biochimie 93: 2048-2053.