Stage:159

From Master 2 Recherche Biosciences Végétales

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Identification de peroxydases de Classe III impliquées dans les événements précoses de germination chez A. thaliana

Laboratoire d'accueil : UMR CNRS-UPS 5546 Laboratoire de Recherche en Science Végétale Pôle de Biotechnologie Végétale, 24 Chemin de Borde Rouge, 31326 Castanet-Tolosan
Equipe d'accueil : Expression et Evolution des Peroxydases et Protéines pariétales et développement
Encadrant(e)(s) : Christophe DUNAND PR UPS (dunand@lrsv.ups-tlse.fr) (tel : 05 34 32 38 57); Vincent BURLAT PR UPS (burlat@lrsv.ups-tlse.fr) (tel : 05 34 32 38 55)

Contexte
La germination est contrôlée par des facteurs externes comme la température, l’eau et la lumière et par l’équilibre hormonal. Récemment, les espèces réactives de l’oxygène (ROS) ont été démontrées agissant comme messagers au cours du développement, des réponses au stress et lors de la mort cellulaire programmée (Gechev and Hille, 2005 ; Laloi et al, 2007 ; Miller et al, 2007 ; Neill et al, 2002). Nous avons analysé le rôle des ROS lors de la germination et étudié la possibilité pour les ROS d’être des molécules de signalisation dans ce processus.
Nous avons montré que lors de la germination, les ROS sont libérés avant la rupture de l’albumen, que la production des ROS est nécessaire à la germination, et qu’une famille de protéines (les peroxydases de classes III) pourraient être impliqués dans la régulation spatio-temporelle de la production de ROS. Dans ce sens, un mutant RNAi d’Arabidopsis thaliana ciblant plusieurs peroxydases de classe III montre une augmentation significative de la vitesse de germination par rapport à des graines d’une plante sauvage.
Les peroxydases de classe III (CIII Prxs) font partie d'une grande famille d’oxydo-réductases spécifique des plantes avec 73 membres pour la plante modèle Arabidopsis thaliana. Grâce à leur variabilité de substrats, les CIII Prxs sont impliquées dans de nombreux processus tout au long de la durée de vie de la plante, y compris lors des étapes précoces de la germination. Cependant, on ignore quelles CIII Prxs sont impliqués dans ce processus, mais plusieurs théories sont avancées quant à leur fonction putative. Les CIII Prxs sont susceptibles d'être impliquées dans i) la protection de la jeune plantule face aux pathogènes en générant en grande quantité des espèces réactives de l'oxygène (ROS), ii) le relâchement de la paroi cellulaire impliquant la production de radicaux de type •OH ou iii) une voie de signalisation dépendante de la lumière impliquant la régulation des niveaux d’H2O2. L’identification est la caractérsiations des CIII Prxs impliquées dans les étapes précoces de la germination chez A. thaliana est donc un challenge important. Des approches de phénotypage, de génétique inverse et de microscopie ont été initiées afin de répondre à cette problématique. Parmi les CIII Prxs, 5 candidats ont été retenus (AtPrx12, 16, 62 ,69 et 71) sur la base de l’analyse de données microtranscriptomiques publiées. Une augmentation ou une e la diminution de la vitesse de germination ont été observées suivant les mutants. La localisation des transcrits de gènes par hybridation in situ indiquent qu’AtPrx69 et AtPrx71 sont tous les deux spécifiquement exprimés dans un tissu impliqué dans la germination de la graine: l'endosperme micropylaire. De plus, nous avons montré qu’AtPrx12 est localisée dans la vacuole, via l’utilisation un système d’expression transitoire chez N. benthamiana. Ces résultats donnent de nombreuses pistes pour la compréhension du ou des rôle(s) joué(s) par certaines CIII Prxs durant la germination d’A. thaliana.

Objectifs
Les objectives majeurs de ce projets sont de
(i) Localiser par hybridation in situ les gènes candidats AtPrx12, 16, 62 dans les phases précoces de la germination: préparation des ribosondes, du matériel végétal, microscopie/scanner de lame et intégration des résultats avec des microtranscriptomiques publiées
(ii) Préparer des constructions GFP pour permettre la localisation subcellulaire des peroxydases 16, 62 ,69 et 71: clonage, transformation et microscopie confocale
(iii) Génotyper et phénotyper les mutants de peroxydases identifiées : techniques de biologie moléculaire et test de germination.

References
Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I. and Laloi, C. (2006). Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioessays 28, 1091-101.
Laloi, C., Stachowiak, M., Pers-Kamczyc, E., Warzych, E., Murgia, I. and Apel, K. (2007). Cross-talk between singlet oxygen- and hydrogen peroxide-dependent signaling of stress responses in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 672-7.
Miller, G., Suzuki, N., Rizhsky, L., Hegie, A., Koussevitzky, S. and Mittler, R. (2007). Double mutants deficient in cytosolic and thylakoid ascorbate peroxidase reveal a complex mode of interaction between reactive oxygen species, plant development, and response to abiotic stresses. Plant Physiol 144, 1777-85.
Neill, S. J., Desikan, R., Clarke, A., Hurst, R. D. and Hancock, J. T. (2002). Hydrogen peroxide and nitric oxide as signalling molecules in plants. J Exp Bot 53, 1237-47.