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Stage:42
From Master 2 Recherche Biosciences Végétales
Laboratoire d'accueil : Laboratoire Interactions Plantes Microorganismes (LIPM), UMR INRA-CNRS 441-2594
Equipe d'accueil : Génétique et génomique des réponses aux stress biotique et abiotique du tournesol, dirigée par Patrick Vincourt.
Encadrant(e)(s) : Laurence Godiard/ Laurence.Godiard@toulouse.inra.fr /Tel : 05 61 28 54 90
Contexte scientifique
Le mildiou causé par l’agent pathogène Plasmopara halstedii est une maladie importante du Tournesol (Helianthus annuus), présentant de nombreuses similitudes avec le mildiou de la vigne causé par Plasmopara viticola. Les Plasmopara sont des oomycètes obligatoires, c’est-à-dire qu’ils ont besoin de la plante pour se développer ; les oomycètes s’apparentent morphologiquement à des champignons mais sont plus proches phylogénétiquement des algues brunes. Le séquencage récent des génomes de deux oomycètes (Phytophthora et Hyaloperonospora) a permis d’identifier une classe d’effecteurs très particuliers, à motif RxLR, ayant la capacité intrinsèque d’être introduit dans la cellule hôte, et de jouer un rôle dans l’interaction avec celle-ci. Le tournesol a été pendant près de vingt ans protégé contre P.halstedii par l’utilisation de résistances totales, conférées par les gènes Pl. Ces gènes majeurs race-spécifiques sont organisés en clusters de gènes NBS-LRR sur le génome. Sous la pression de sélection associée au déploiement de ces gènes en culture, des races virulentes du parasite sont progressivement apparues. Aussi, dans la perspective de développer une résistance plus durable, de nouvelles sources de résistances ont été recherchées et une résistance quantitative forte (LOD 10) indépendante des gènes Pl décrits, a été cartographiée sur le LG10 dans une population de lignées recombinantes. Une cartographie génétique fine du QTL fondée sur le criblage d’une banque BAC construite pour ce projet, a été entreprise en collaboration avec le CNRGV et fait l’objet du projet de thèse de Falah As-Sadi (soutenance début 2011). Actuellement l’intervalle de confiance du QTL correspond à 2.3 cM.
Parallèlement à ce travail de clonage positionnel, nous avons entrepris de mieux caractériser l’interaction Tournesol-P.halstedii à la fois du côté de la réponse de la plante à l’infection, et du côté de l’agent pathogène par la recherche de nouveaux gènes (150 séquences étant disponibles dans les bases de données), et surtout de gènes codant des effecteurs. Pour cela, un séquencage massif (pyroséquençage 454®) d’EST provenant de génotypes compatible et incompatible de tournesol infectés par une race de P.halstedii (710) a conduit à la caractérisation de 23 000 nouvelles séquences pouvant provenir de la plante ou de l’agent pathogène. Des recherches d’homologie par blast effectuées sur différentes collections de cDNA (de plante uniquement, de tournesol, ou d’oomycètes) nous ont permis d’identifier 500 séquences provenant de P.halstedii, et parmi celles-ci 2 effecteurs potentiels présentant les motifs conservés décrits chez les oomycètes de type Crinkler et de type RxRL.
Objectifs
Le travail s’articulera autour de 2 axes :
• Le premier axe concerne l’analyse des mécanismes moléculaires mis en jeu lors de la résistance quantitative associée au QTL de résistance, et leur comparaison avec ceux impliqués dans des résistances de type gène-spécifique médiées par les gènes Pl. Pour cela, nous utilisons les parents des lignées recombinantes qui possèdent ou non les gènes Pl d’intérêt, et de lignées recombinantes possédant ou non le QTL, inoculés par des races adéquates révélant ainsi des interactions compatibles ou incompatibles. Des hybridations sur puces Affymetrix® de tournesol à partir de ces échantillons végétaux sont en cours d’analyse. Le travail de l’étudiant consistera à la production de matériel végétal inoculé et à la validation par RT –qPCR des données d’hybridation de puces en utilisant la technique Fluidigm® adaptée au traitement simultané de nombreux échantillons de cDNA et de gènes à tester.
• Le second axe repose sur l’étude des 2 effecteurs RxLR et Crinkler de P.halstedii. Le travail consistera à produire par race-PCR® les cDNA pleine taille, et à les cloner dans un vecteur d’expression d’Agrobacterium tumefaciens afin de tester leur effet in planta par la méthode d’Agroinfection chez Nicotiana benthamiana et chez le tournesol.
Techniques
Extraction d’ARN, qRT-PCR, PCR, séquençage, clonage, expression transitoire, agroinfection.
Equipe d’accueil
L’équipe de génétique et génomique du tournesol du LIPM a été créé il y a 3 ans (http://lipm-helianthus.toulouse.inra.fr/dokuwiki/). Nous disposons de chambres de culture pour les inoculations en conditions contrôlées. Nous développons des outils bioinformatique (http://www.heliagene.org/) et transcriptomique sur le tournesol en collaboration avec des partenaires publics et privés.
Références
Identification of non-TIR-NBS-LRR markers linked to the Pl5/ Pl8 locus for resistance to downy mildew in sunflower. RADWAN O., BOUZIDI M.F., VEAR F., PHILIPPON J., DE LABROUHE D.T., NICOLAS P., MOUZEYAR S., Theor Appl Genet 106 (8): 1438-1446 (2003).
Inheritance of quantitative resistance to downy mildew (Plasmopara halstedii) in sunflower (Helianthus annuus L.) VEAR F., SERRE F., JOUAN-DUFOURNEL I., BERT P.F., ROCHE S., WALSER P., TOURVIEILLE DE LABROUHE D., VINCOURT P. Euphytica (2008).
Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. MANAVELLA PA and CHAN RL. Nature protocols 4:1699-1707 (2009).
Analysis of the Helianthus annuus-Plasmopara halstedii transcriptome using a pyrosequencing approach. AS-SADI F. et al., en préparation.